四翅滨藜AcDREB2转录因子的克隆及功能分析

发布时间：2020-11-21 06:05

　　 盐和干旱是范围最大,影响最广的非生物逆境胁迫,也是全球农业生产的两大主要限制因素。盐和干旱胁迫都会引起细胞失水,破坏细胞内稳态平衡,致使细胞内生理生化代谢紊乱,严重影响植物的正常生长发育。为了在日益严重的恶劣环境中生存和繁殖,陆地植物进化出复杂的调控系统来响应胁迫信号以提高植物的适应能力。在盐和干旱胁迫下,很多抗逆相关基因被大量诱导表达,而这些基因的表达除了受脱落酸(ABA)信号途径调控以外,还可以通过ABA非依赖性途径调控,其中脱水应答元件结合蛋白(DREB)就在这个过程中发挥重要作用。然而,关于这类转录因子的研究大多还是集中在抗逆能力有限的作物及模式植物中,而在适应能力超强的荒漠盐生植物中的相关研究较少。四翅滨藜(Atriplex canescens)长期生活在贫瘠的盐碱荒漠地区,具有超强的适应能力,进化出了独特的抗逆机制。前期关于四翅滨藜抗逆机理的研究主要集中在生态恢复、种子萌发、生理适应和离子转运等方面,对其转录因子在抗逆过程中的功能研究还未见详细报道。因此,本研究克隆了四翅滨藜脱水响应元件结合蛋白编码基因AcDREB2,对其响应盐和渗透胁迫的表达模式进行了分析,同时验证其转录激活活性,并将其在拟南芥中超表达,以期进一步明晰AcDREB2在植物耐盐抗旱过程中的功能。主要取得以下研究结果:(1)AcDREB2基因全长cDNA为867 bp,其中CDS序列729 bp,共编码242个氨基酸,其N端含有1个该类基因特有的AP2/EREBP保守结构域,其中第14位氨基酸残基是保守的缬氨酸。氨基酸序列比对发现,AcDREB2与已报道的其它同科植物和抗逆性强的荒漠植物的同源性较高。(2)在NaCl或渗透胁迫处理下,AcDREB2在四翅滨藜叶中表达量均显著高于根和茎组织,且在处理3 h时表达量急速上升,表明AcDREB2的表达受盐和渗透胁迫处理的快速诱导。(3)AcDREB2定位于细胞核,具有转录激活活性,能顺利结合DRE顺式元件,激活其下游报告基因的表达。推测AcDREB2在植物响应逆境过程中发挥重要调控作用。(4)AcDREB2超表达提高了转基因拟南芥的耐盐和抗旱能力。200 mM NaCl处理15天后,野生型植株矮化,叶片发黄萎蔫,而AcDREB2超表达植株的长势良好。通过比较分析生物量、叶绿素含量、光合参数、相对含水量、质膜透性、离体叶片失水速率等各项指标,发现超表达植株均优于野生型。同样地,在周期性干旱处理14天后,AcDREB2超表达植株的生物量、叶绿素含量、净光合速率、气孔导度、水分利用效率、相对含水量均显著高于野生型,离体叶片失水速率也较野生型明显降低。综上所述,AcDREB2能对外界盐和渗透胁迫环境做出快速响应,其超表达能够通过调控植物对水分的吸收,维持体内水分平衡,提高光合效率,从而缓解盐及干旱胁迫对植物的损伤,显著提高转基因拟南芥的耐盐抗旱能力。说明该转录因子在四翅滨藜抗逆性中发挥着重要作用。
【学位单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：

兰州大学硕士学位论文 四翅滨藜 AcDREB2 转录因子的克隆及功能分析进行 Real-time PCR 反应。3.1.7 转录活性分析3.1.7.1 酵母表达载体构建本实验所用酵母载体有两个，分别是 pGADT7 AD 和 pGBKT7 (图 3-1)，酵母菌株为 Y2Hgold 和 Y187。载体和菌株均由兰州大学生命科学学院提供。通过 In-Fusion无缝克隆技术构建酵母表达载体。

图 3-2 pCAMBIA1302 的载体图谱Fig. 3-2 Vector map of pCAMBIA1302植物表达载体构建cDREB2 基因的植物表达载体是在上述亚细胞定位载体的基础上，把 3 RD29A 诱导型启动子，根据 pCAMBIA1302 和 RD29A 序列设计 In-Fu P19 和 P20(表 3-3)，载体构建过程同 3.1.7.1。构建成功的植物表达载29A-pCAMBIA1302-Bar-AcDREB2。同样使用冻融法将植物表达载体转3101。 AcDREB2 转基因拟南芥获得及鉴定盛花期使用农杆菌花序侵染法(Bechtold 和 Bouchez，1995)将 AcDREB中，同时以转化pCAMBIA1302空载体的植株作为对照，使用BASTA (0所获得的转基因拟南芥植株筛选至 T3代以获得纯合抗性植株。通过半定测转基因拟南芥中 AcDREB2 的表达量，AcDREB2 鉴定引物为 P21 和

AcDREB2功能域分析
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本文编号：2892646