光响应蛋白调控细胞黏附和迁移

发布时间：2020-11-22 05:11

　　 对细胞粘附和迁移的远程、时空和可逆控制对于许多生物技术应用和细胞疗法是非常重要的实现手段。在本文中,我们展示了在修饰有插入Arg-Gly-Asp(RGD)配体的光响应蛋白LOV2的表面上实现光调控细胞的粘附和迁移。蓝光照射引起LOV2的结构变化,并暴露RGD序列,导致蛋白质粘附和迁移增强。把表面放回黑暗的环境会导致配体重新“笼住”,细胞分离。黏附和迁移可在多个循环中可逆调节。通过精确控制光的位置,可以实现细胞的定向迁移。利用光控蛋白结构控制配体的显示实现细胞黏附和迁移的可逆和时空控制,对于准确定义和调节细胞材料在体外和体内的相互作用具有很大的前景。第一章介绍了文章的背景知识,所用到的材料和实验方法。首先我们对光响应蛋白及其应用进行了简单介绍,又介绍了课题中所用到的LOV2蛋白,我们提到了它的来源及其在光调控下的性质。随后我们介绍了细胞黏附和迁移的基本情况,它的生物学意义和分子基础,我们重点提及了整合素和RGD序列在细胞黏附中的作用。第二章详细介绍了对LOV2突变蛋白的设计和实验方法,对其性质进行了初步的测试。我们在LOV2蛋白的J α螺旋上选择了两个RGD序列的插入位点,它们对LOV2蛋白的结构影响最小。另外,设计了在LOV2蛋白C端连上RGD序列作为阳性对照和把前述三种RGD换成RGE作为阴性对照。所设计的六种突变蛋白具有和原始LOV2蛋白相同的光调控性质,它们在光照和黑暗状态下的颜色变化可用肉眼直接观察到,我们又测量了它们的UV,荧光和CD光谱。在第三章中,我们设计了以酶联免疫吸附测定(ELISA)为基础的结合性ELISA实验和竞争性ELISA实验来验证LOV2蛋白的光控解折叠功能,以及解开折叠后的暴露的RGD序列是否能够被整合素蛋白相结合,以实现预想的蛋白功能。结果显示突变蛋白与整合素结合符合我们的预期,在光照下结合得很好而在黑暗下则结合很弱。第四章我们介绍了通过把细胞在修饰有LOV2突变蛋白的培养基表面上培养,可以实现光调控细胞的黏附和迁移。由于蓝光照射可致LOV2突变蛋白的Jα螺旋展开,使得其中的RGD序列暴露出来,因而能使整合素与之结合,从而细胞可以黏附上去;在黑暗状态下,突变蛋白发生结构变化,展开的部分重新折叠成Jα螺旋,RGD序列被隐藏起来,细胞也与突变蛋白分离。利用这个性质,我们用一个移动的光纤照射表面实现了调控细胞的运动,细胞会朝着光照射的位点移动。我们也观察了细胞在黏附过程中所发生的形态变化及其分离时的可恢复性。最后,我们对以上工作进行了总结,并提出进一步深入研究的展望。
【学位单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q25
【部分图文】：

其亚细胞定位、稳定性甚至与特定目标的相互作用进行光控制。（２）蛋白质活性的空和变构调控。如果光能控制初级结构，那么对折叠蛋白质的直接光控制呢？最近的两旨在利用独特的策略来解决这一长期存在的挑战。一种是基于“蛤壳”蛋白的概念，其活性区域两侧蛋白质的两端能相互结合，在空间上阻止该区域与下游目标相关联。在调节这类Ｎ端和Ｃ端序列之间的联系被证明足以调节蛋白质活性［１８］。为了使这种设基于光的控制，林和他的同事设计了荧光蛋白Ｄｒｏｎｐａ的变体，其与同种二聚体可以在分离。通过将丨）ｒｏ叩ａ的拷贝融合到不同靶蛋白的Ｎ和Ｃ端，他们实现了对多种鸟嘌呤交换因子、病毒蛋白酶和一系列哺乳动物激酶的光控制。Ｈａｈｎ等意识到前面描述的Ｌ０的Ｎ和Ｃ端在黑暗中相距约１０Ａ％并且该距离因ｊｏｔ螺旋的光诱导展开而增大［１９］。在创性研究中，作者使用结构分析来确定Ｌ０Ｖ２插入蛋白的位置，使其两端运动与蛋白质性位点相耦合，用这种方法他们能够设计成若干激酶、Ｒｈｏ家族ＧＴＰａｓｅ和ＧＥＦｓ的光开关。类似的方法现己扩展到其他蛋白质，包括凋亡蛋白酶ｃａｓｐａｓｅ－３［２０］。??（ａ）?ｌｉｈｔ－ｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ?ｌｉｎｅａｒ?ｍｏｔｉｆ?ｃｌａｍｓｈｅｌｌ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ?ｃｏｎｔｒｏｌ??

０＝６、??ＨＯ?ＯＨ??图１．４?ＦＭＮ分子结构??１．２．２?ＬＯＶ２蛋白空间结构与光调控下的结构变化??从敁仞的发现汗始，ＬＯＶ蛋白就相继在细菌、藻类、真菌和植物中被发现。ＬＯＶ蛋「Ｉ山??于在中间位置结合ｆ?？个黄素单核ｆｆ酸所以能够起到蓝光感受器的作用。在大肠杆菌中表达??和纯化的蛋白是黄色的且在蓝光激发下呈现绿色的荧）ＦＭＮ在信号传导状态下（蓝光照射??Ｋ?）通过相邻的半胱氨酸残堪与蛋「Ｉ核心共价连接［５７］。??７??

在荧光显微镜下可以观察到，当ＬＯＶ蛋白暴露在光下后，会经历一整个光循环。，ＬＯＶ蛋白会通过一个非共价相互作用结合ＦＭＮ基团，这个形态的蛋白在４４７ｎ的吸收峰［５８，５９］。当被蓝光照射后，ＦＭＮ生色团与ＬＯＶ２中相邻的半胱氨酸残。这随后介导激酶的激活，该激酶通过促进向光素自磷酸化在生物体内诱导信己发现ＬＯＶ２结构域的光化学反应性对激酶的激活至关重要，但蛋白质ＬＯＶ１内的功能仍不清楚。??ｒ?ｒ??Ｘａ＾Ｊｈ?＾??＼?Ｃｙｓ??Ｃｙｓ??图１．６蓝光照射下的，ＦＭＮ?＿向光素的半胱氨酸残基形成共价化合物??
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本文编号：2894180