哺乳动物精子发生过程中RNA编辑和miRNA编辑的系统性研究

发布时间：2020-11-22 06:53

　　 当今世界不孕症越来越受人们的关注,全世界大约有15%的夫妇受到不孕症的影响,其中约半数都是男性生殖异常引起的,而精子发生障碍是导致男性不育的一个重要因素。我们的工作旨在通过深入地了解精子发生过程,分析影响精子发生过程中基因表达的转录和转录后调控的分子机制,为寻找精子发生障碍的可能成因和治疗方法提供指导思路。精子发生是一个复杂而动态的过程,需要一系列基因在其各个阶段协调且精准的表达,任一阶段的基因表达失调都有可能会造成精子发生障碍。而RNA编辑和miRNA编辑作为重要的基因转录后调控方式,通过RNA水平上碱基的取代和加减,以更加灵活高效的方式影响和调节基因的表达。但是RNA编辑和miRNA编辑是否存在于雄性生殖细胞中,如果存在,其在不同生殖细胞中的分布情况怎样、作用于哪些生殖基因、是否会影响这些基因的表达,这一系列问题都尚未解决。在本研究中,我们收集了目前已公开发表的RNA-seq数据,从编码和非编码RNA两个方面系统的分析了精子发生过程中多个阶段生殖细胞的RNA编辑情况,并对一些在精子发生过程中发挥重要作用的基因和miRNA的编辑情况进行详细阐述。具体过程和结果如下:1.精子发生过程中RNA-seq数据平台搭建我们从GEO和SRA数据库中收集了小鼠精子发生的RNA-seq数据和small RNA-seq样本,分别作为RNA编辑和miRNA编辑检测的实验数据集。并用这些数据集搭建我们精子发生过程的RNA-seq数据平台。我们根据细胞类型对数据进行分组,并将同一细胞类型的数据整合成一个样本。结果显示整合策略在一定程度上增加了测序深度,同时可以获得不同样本中一致的编辑位点,与分别检测每个样本中的RNA编辑位点相比,该方法可以提高准确性。2.精子发生过程中的RNA编辑我们在小鼠精子发生过程的7种生殖细胞里检测到了7530个编辑位点共发生在2012个基因中。这些编辑位点在一些染色体上呈现特殊分布,在17号染色体上的分布密度最高,Y染色体上的编辑位点只分布在Y染色体的两端。编辑位点主要分布在内含子区,基因间区和编码区,并且编码区的编辑位点中将近一半都会导致氨基酸的改变。而很多在精子发生过程中起重要作用的基因都被检测到了非同义编辑事件,如:Ddx3x,Hjurp,Adad1,Tssk6等,反映了RNA编辑在精子发生过程中对重要基因表达的灵活调控。3.精子发生过程的miRNA编辑我们从小鼠和猪中分别鉴定了630个和261个编辑位点。两个物种之间有许多miRNA编辑现象是一致的,例如编辑位点在各细胞的数量分布,编辑类型,以及种子区和非种子区中A-to-I编辑的分布密度。并且无论是在小鼠还是在猪中,近一半的miRNA编辑事件都发生在种子区,这意味着近一半的编辑事件都可能会影响miRNA的功能。最后,我们发现在精子发生过程中频繁被编辑的miR-34c通过改变其结构来调节靶基因,并在编辑时显示出功能障碍。总之,我们描绘了小鼠和猪精子发生期间miRNA编辑的整体概况。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78;Q132.1
【部分图文】：

其中约半数都是男性生殖异常引起的，而精子发生障碍是导致男性不育的一个重要因素(JPet al. 2002; Pizzol et al. 2014;Agarwal et al. 2015)。因此，揭示精子发生的分子机制对于理解男性不育至关重要。精子发生是一个复杂且连续动态变化的过程(Bai et al. 2017)，主要分为三个阶段：有丝分裂、减数分裂和成熟精子的形成。如图 1-1 所示精原细胞经过有丝分裂形成初级精母细胞。第一次减数分裂后形成单倍染色体的次级精母细胞。第二次减数分裂后形成的圆形精子形态为圆形且染色体数目减半。最后圆形精子细胞在去除了细胞中多余的细胞器，形态也发生了显著的变化后形成成熟的精子(Kotaja et al. 2004; Miller et al. 2013;Rathke et al. 2014)。这一过程需要连续，协调且精准地表达数千个基因，并与来自转录，转录后和翻译基因调控的多级调节相结合(Che et al. 2016)。因此，任一阶段的基因表达失调都有可能导致精子发生障碍，所以只立足于某一阶段某个基因去研究精子发生已不再具有优势。近年来高通量测序技术的发展，为我们提供了越来越多的转录组测序数据以供研究。统览精子发生的多个阶段，不同于单一基因表达，从转录后调控的角度去研究精子发生过程中影响基因表达的因素，将为研究精子发生，探究其分析机理提供新思路。

图 1-2 腺嘌呤氧化脱氨基反应 (Bass 2002)Fig. 1-2 Adenine oxidative deamination reaction (Bass 2002)图 1-3 3 种 ADAR 蛋白 (Walkley and Jin 2017)Fig. 1-3 Three kinds of ADAR proteins (Walkley and Jin 2017)

图 1-3 3 种 ADAR 蛋白 (Walkley and Jin 2017)Fig. 1-3 Three kinds of ADAR proteins (Walkley and Jin 2017)1.2.2 RNA 编辑识别工具RNA 编辑位点的检测从理论上来讲是通过比较 RNA 序列和基因组序列，寻找到两种水平测序数据之间的差异，从而找到相比于基因组在 RNA 水平上发生变化的位点即 RNA 被编辑的点。因此识别 RNA 编辑位点很大程度上需要 RNA-seq 和 DNA-seq 的进步，随着高通量测序技术的发展，不同物种的各个组织中越来越多的 RNA 编辑位点被揭示。RNA 编辑检测有很多种方法。由于存在着一定的技术局限性导致成本较高或者结果假阳性率偏高，目前已经很少使用比较基因组法、延伸终止法以及基于 EST 序列的基因组序列比对法等试验方法去检测RNA 编辑位点，随着测序成本越来越低，测序数量逐步增多，为研究人员提供了大量的数据资源，因此通过生物信息学方法识别 RNA 编辑位点越来越常见。由此而出现了很多用于识别RNA编辑位点的工具，迄今常见的有8种：REDItools(Picardi and Pesole 2013)、GIREMI (Zhang and Xiao 2015)、RED (Sun et al. 2016)、
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本文编号：2894306