CRISPR/Cpf1系统在谷氨酸棒杆菌ATCC 14067基因组编辑中的研究

发布时间：2020-12-19 06:31

　　谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）在微生物发酵工业上具有很大的应用潜力,可以通过代谢工程来生产多种氨基酸,而基因组编辑技术在其代谢工程中发挥着重要的作用。在谷氨酸棒杆菌中,传统的基因组编辑技术都存在着重组效率低,耗费时间长等缺点,难以满足工业菌株改造的需求。此外,由于不同菌株之间的基因组差异,导致基因组编辑技术的适用性也存在一定的限制,例如SacB反向筛选系统并不适用于谷氨酸棒杆菌ATCC 14067,因此仍需进一步来探究新的基因组编辑技术。基于此,本研究以谷氨酸棒杆菌ATCC 14067为研究对象,初步建立了基于CRISPR/Cpf1的基因组编辑系统,并进一步通过不同PAM和可编辑位点范围的探究优化了该系统在谷氨酸棒杆菌中的应用,然后将其成功应用于谷氨酸棒杆菌的多基因同时编辑和DNA大片段的删除上。该技术有效完善了谷氨酸棒杆菌ATCC 14067的基因组修饰系统,为其代谢途径的改造奠定了夯实的基础。具体研究内容及结果如下:（1）谷氨酸棒杆菌ATCC 14067中基于CRISPR/Cpf1的基因组编辑技术的建立与优化首先通过测试双质粒（pJYS1Pta... 

【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：83 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

谷氨酸棒杆菌应用于多种化合物的生产Fig.1-1Corynebacteriumglutamicumusedintheproductionofvariouscompounds

测性和调节性；阻断一些非必需的代谢途径可以有助于提高细胞转化靶向生物制品的率；强化一些必需的代谢途径可以大大提高细胞转化靶向生物制品的效率。在早期的十几年中，基于两轮同源重组的 SacB 反向筛选系统已广泛应用于谷氨棒杆菌的基因组工程中，该系统利用果聚糖酶 SacB（SacB 能够将蔗糖分解为葡萄糖果糖，并将果糖聚合为果聚糖，对谷氨酸棒杆菌有致死性）作为反向筛选标记，经过轮单交换完成靶标基因的编辑。但该系统是通过菌株自身的同源重组系统来完成两次交换，重组效率较低，且阳性转化子的概率＜50%[14-16]。此外，Cre/loxP 重组系统也泛应用于谷氨酸棒杆菌基因组上 DNA 片段的敲除和替换[17]。Cre/loxP 重组系统是由 C重组酶和其所识别的两个 loxP 位点共同组成，Cre 酶介导两个 loxP 位点完成分子内组，使 loxP 位点间的序列被剪切，并留下 1 个 loxP 位点。而对应的 Cre/mutant lox 系是将 loxP 位点改造为突变的 lox71、lox66 序列，二者之间的序列被 Cre 酶切割后，留不被 Cre 酶识别的突变 lox72 序列，可用于基因片段的连续无痕敲除[18]。然而，该方也是费力耗时的，仍需进一步开发新的基因组编技术。

华南理工大学硕士学位论文RecFACS 方法中，异源基因整合到染色体中是基于多重自动化基因组工程概念，其中使用由不同噬菌体编码的同源重组蛋白将单链 DNA 直接引入细菌染色体中。突变体的筛选是通过快速自动荧光激活细胞分选（FACS）完成。然而，RecFACS 方法需要构建靶基因特异性生物传感器和 FACS 用于菌落筛选，妨碍其在系统基因组工程中的应用[19]。此外，在我们之前的研究中，通过在谷氨酸棒杆菌 ATCC 14067 中优化外源核酸外切酶-重组酶对 RecET 协助外源线性 dsDNA 重组的条件，提高了 RecET 在谷氨酸棒杆菌中的重组效率；建立 RecET 介导的自我切割线性双链 DNA 的重组系统（RecET-Cre/lox系统），实现了基因组上靶标基因的连续无痕敲除，其基因敲除的效率高达 94%以上[20]。

【参考文献】：
期刊论文
[1]基于CRISPR系统基因编辑与基因调控技术的发展[J]. 杨明辉,陶景丽,柴孟龙,吴昊,连正兴,刘国世.  农业生物技术学报. 2018(02)
[2]新一代基因组编辑系统CRISPR/Cpf1[J]. 杨帆,李寅.  生物工程学报. 2017(03)

博士论文
[1]谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067中L-精氨酸合成途径的反馈抑制机制解析及其代谢工程改造[D]. 黄园园.华南理工大学 2018

硕士论文
[1]谷氨酸棒状杆菌基因敲除系统的构建[D]. 谭延振.江南大学 2012



本文编号：2925437