里氏木霉中CRISPR-Cas9基因组编辑及木糖调控基因表达方法的建立
发布时间：2020-12-20 09:30
里氏木霉（Trichoderma reesei）是生产纤维素酶的重要工业菌株,同时也可用于表达多种外源蛋白,但目前对其进行基因组编辑的技术尚不成熟,表达严重依赖于CBH1表达系统。本论文对里氏木霉中的基因组编辑进行了研究,并尝试开发了CBH1的补充表达系统。本研究取得了如下结果:1.CRISPR-Cas9技术在里氏木霉的初步建立本研究通过胞内表达Cas9和体外装载Cas9-gRNA两种方法进行基因敲除以及在此基础上定点插入基因的方法。首先,在里氏木霉QM9414菌株胞内表达Cas9,并转化体外转录的gRNA,得到了5-FOA抗性的转化子,ura5基因发生了脱靶的基因编辑现象,在靶位点下游70-和100-bp处插入/缺失9-或12-bp。其次,将胞外组装的Cas9-gRNA和带有pyr4标记基因的质粒共转化到里氏木霉TU-6菌株,当靶向主要的外切纤维素酶cbh1时,发现在27个转化子中有8个转化子失去了表达CBH1的能力,这表明通过基因组编辑成功地敲除了cbh1基因。进一步的序列分析表明,在靶位点处插入了共转化质粒、染色体基因,或两者的混合物。此外,研究了定点插入基因的方法,在HDR介导...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR-Cas9干扰外源DNA入侵的示意图（方锐等，2013）
院硕士学位论文 制 RNA 聚合酶和上游启动子的结合，从而激活或抑制下游相对应的基因的表达，以此为基础构建的生物传感器，已经广泛应用于大肠杆木霉及哺乳动物细胞等多种生物。基于转录因子的生物传感器的结构Wang et al., 2016)利用细菌的转录因子 XylR 和真核生物启动子，建立了/调节基因元件，系统地设计和验证了细菌的阻遏蛋白为基础的木糖感应母中建立了一种以细胞分选为基础的，快速、有力的高通量筛选木糖转糖转运子的突变体 HXT14，在木糖的转运能力上提高了 6.5 倍。(Ellis et al., 2012)利用枯草芽孢杆菌的转录抑制因子 FapR，建立了反应lonyl-CoA）浓度的生物传感器，阻遏蛋白 FapR 的表达会抑制与脂肪酸，而丙二酰辅酶 A 浓度的变化会调控下游报告基因的转录，通过荧光信Teo et al., 2015)利用三种不同的细菌来源的 XylR 阻遏蛋白和合成的启了生物传感器，通过木糖的浓度调节荧光报告基因的表达，实验结果响 XylR 对报告基因阻遏的能力。此外，在工程酵母细胞培养过程中表达量的增加。
图 2.1 重组表达质粒 pPdc1-cas9Fig. 2.1 Recombinant expression plasmid of pPdc1-cas9选对 12 个 cas9 转化子进行 PCR 扩增，扩增产物通过增条带为 200-bp，除去泳道 8 和 12 之外，剩余的 9 验。图 2.2 PCR 鉴定里氏木霉转化子中 cas9 基因M：DNA marker；泳道 1-12 为转化子ration of the cas9 gene in T. reesei transformants by PCR. M: DNA
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9在丝状真菌基因组编辑中的应用[J]. 李红花,刘钢. 遗传. 2017(05)
[2]ZFNs、TALENs和CRISPR-Cas基因组靶向编辑技术及其在植物中的应用[J]. 廖鹏飞,聂旺,余雅心,童普国,李绍波,朱友林. 基因组学与应用生物学. 2016(02)
[3]纤维素酶的研究进展与发展趋势[J]. 顾方媛,陈朝银,石家骥,钱世钧. 微生物学杂志. 2008(01)
本文编号：2927628
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR-Cas9干扰外源DNA入侵的示意图（方锐等，2013）
院硕士学位论文 制 RNA 聚合酶和上游启动子的结合，从而激活或抑制下游相对应的基因的表达，以此为基础构建的生物传感器，已经广泛应用于大肠杆木霉及哺乳动物细胞等多种生物。基于转录因子的生物传感器的结构Wang et al., 2016)利用细菌的转录因子 XylR 和真核生物启动子，建立了/调节基因元件，系统地设计和验证了细菌的阻遏蛋白为基础的木糖感应母中建立了一种以细胞分选为基础的，快速、有力的高通量筛选木糖转糖转运子的突变体 HXT14，在木糖的转运能力上提高了 6.5 倍。(Ellis et al., 2012)利用枯草芽孢杆菌的转录抑制因子 FapR，建立了反应lonyl-CoA）浓度的生物传感器，阻遏蛋白 FapR 的表达会抑制与脂肪酸，而丙二酰辅酶 A 浓度的变化会调控下游报告基因的转录，通过荧光信Teo et al., 2015)利用三种不同的细菌来源的 XylR 阻遏蛋白和合成的启了生物传感器，通过木糖的浓度调节荧光报告基因的表达，实验结果响 XylR 对报告基因阻遏的能力。此外，在工程酵母细胞培养过程中表达量的增加。
图 2.1 重组表达质粒 pPdc1-cas9Fig. 2.1 Recombinant expression plasmid of pPdc1-cas9选对 12 个 cas9 转化子进行 PCR 扩增，扩增产物通过增条带为 200-bp，除去泳道 8 和 12 之外，剩余的 9 验。图 2.2 PCR 鉴定里氏木霉转化子中 cas9 基因M：DNA marker；泳道 1-12 为转化子ration of the cas9 gene in T. reesei transformants by PCR. M: DNA
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9在丝状真菌基因组编辑中的应用[J]. 李红花,刘钢. 遗传. 2017(05)
[2]ZFNs、TALENs和CRISPR-Cas基因组靶向编辑技术及其在植物中的应用[J]. 廖鹏飞,聂旺,余雅心,童普国,李绍波,朱友林. 基因组学与应用生物学. 2016(02)
[3]纤维素酶的研究进展与发展趋势[J]. 顾方媛,陈朝银,石家骥,钱世钧. 微生物学杂志. 2008(01)
本文编号：2927628
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