基于碱基转换的基因敲除方法研究

发布时间：2021-01-06 09:27

　　高效特异的基因敲除技术对于转基因动物的制备,临床生物治疗的发展以及人类遗传病的预防和治疗具有重要意义。目前广泛应用的基因敲除技术包括ZFN,TALEN以及基于胚胎干细胞的DNA同源重组,这些技术均基于错配修复的原理,通过使用相关的核酸内切酶切割DNA分子双链,进而实现基因的敲除。在实践中,这些技术都存在明显缺陷,繁琐而效率低下,且会造成一定数目的碱基序列改变,所以对基因的编码区和对基因表达有一定调节功能的内含子均会产生一定的影响。最近几年发展起来的CRISPR/Cas9基因编辑技术可以更为高效、快速地实现对特定基因序列的敲除,但其特异性较差,存在严重脱靶效应,且切割序列难以控制等缺点。因此开发具有高效率,高特异性并且可对DNA碱基序列改变可控的新基因敲除方法是促进对基因功能研究,经济转基因动物制备及重大疾病的生物治疗的现实所需,具有重要的理论意义和重要的临床及经济价值。最近发展起来的基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的碱基转换技术可以准确地对引导RNA靶序列中某些单碱基进行转换,该技术可以在只有DNA分子单链断裂的情况下实现碱基的转换。利用该方法可以实现对目的基因更为精确、高效地定... 

【文章来源】：东北师范大学吉林省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：59 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

构建小鼠基因敲除模型流程示意图

图 1.2 ZFN 结构示意图[9]至今为止，基于 ZFN 的基因打靶技术已经在多种生物中得到运用。2003 年成功利用 ZFN 技术使得果蝇发生突变，实现了动物体的基因敲除[10]。随后]，斑马鱼[12]，拟南芥[13]等模式生物中，ZFN 介导的基因打靶技术也成功得后的研究中，ZFN 技术成功地在各种植物和动物中实现了基因的敲除。同早期的基因打靶技术而言，ZFN 技术的基因打靶效率有所提高，但该技术的缺点和局限。首先，目前对于 ZFN 和 DNA 靶序列的相互作用关系了解还

到宿主 DNA 并激活，进而导致宿主患病[14]。这些 TAL 效应物经过细菌的 III 类统进入到植物细胞中，通过调节基因启动子来调节转录，进而促进细菌的生长和由于 TAL 效应物可以与特定序列特异性结合，于是同 ZFN 技术类似，研究人员核酸酶与一段人造 TAL 效应物连接起来，创造出了具有特定基因编辑功能的强 TALEN。TALEN 主要结构一般由三部分组成，一个是 N 端结构域，由核定为信号 NLclear localization signal）组成；一个是中央结构域，由 TALE 重复序列组成，该可特异性识别 DNA 序列；一个是 C 端结构域，由 FokI 核酸酶组成。通常，TALE央结构域是由一系列约 33-35 个氨基酸构成的重复多肽，每一个结构域都可以特别一对碱基。在这些氨基酸中，绝大多数氨基酸都是保守的，只有第 12 位和第 氨基酸是可变的。因此，这两个氨基酸也称之为重复可变的双氨基酸残基（repeble di-residue, RVD）。RVD 不同的序列排序可以识别不同的碱基，四种碱基 A、T 都具有其相应的 RVD，分别是 NI、NG、HD 以及 NN，因此 RVD 控制了 TALE域特异性识别的碱基序列。在构建人工 TALEN 核酸酶时，可以根据 RVD 的规则识别不同序列的结构域。


本文编号：2960328