人Nek2蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备

发布时间：2021-04-11 20:34

　　目的:通过原核表达系统表达人Nek2蛋白,优化表达条件并纯化Nek2蛋白,制备抗Nek2多克隆抗体。方法:将Nek2基因片段构建到原核表达载体pET30a（+）上,转化大肠杆菌BL21（DE3）;加入诱导剂IPTG诱导表达,对诱导温度、诱导剂IPTG终浓度、诱导时间等条件进行优化;利用12%SDS-PAGE后250mmol/L KCl染色切胶纯化蛋白质,将纯化后的Nek2蛋白进行质谱鉴定;纯化Nek2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用ELISA、Western blot和免疫荧光实验检测多克隆抗体效价和特异性。结果:构建了pET30a（+）-Nek2重组原核表达质粒,诱导的重组人Nek2蛋白主要以包涵体的形式存在;蛋白质的最适诱导表达条件为28℃,180r/min条件下加入终浓度为0. 2mmol/L IPTG诱导32h;质谱分析纯化后的蛋白质为Nek2蛋白,最终获得浓度为1. 35mg/ml纯化后的Nek2蛋白;纯化蛋白免疫小鼠,多克隆抗体效价大于1∶243 000,且具有良好的抗原特异性;免疫荧光实验显示Nek2主要定位于细胞质和细胞核。结论:利用重组人Nek2蛋白获得具... 

【文章来源】：中国生物工程杂志. 2020,40(03)北大核心CSCD

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

p ET30a(+)-Nek2载体构建

12%SDS-PAGE结果显示，随着温度升高，蛋白质表达量增加，28℃时蛋白质表达量最高(P<0.05)，温度进一步上升，蛋白质表达量开始下降(图2b、图3a)，说明重组人Nek2蛋白最适诱导温度为28℃。不同浓度的IPTG对蛋白质进行诱导，与0.4mmol/L和0.6mmol/L组相比，0.2mmol/L组蛋白质表达量相对较高(P<0.05)，而与0.8mmol/L和1.0mmol/L组相比没有差异(P>0.05)(图2c、图3b)，因此确定IPTG的最适诱导终浓度为0.2mmol/L。随着诱导时间的延长，重组人Nek2蛋白的表达量逐渐递增，32h时蛋白质表达量最高(P<0.05)，超过32h蛋白质表达量开始下降(图2d、图3c)，说明蛋白质最适诱导时间为32h。图3 不同条件下电泳条带的灰度值

不同条件下电泳条带的灰度值

【参考文献】：
期刊论文
[1]家蝇抗菌肽AMPs17蛋白原核表达条件的优化及其抗真菌活性检测[J]. 杨隆兵,国果,马慧玲,李妍,赵欣宇,苏佩佩,张勇.  中国生物工程杂志. 2019(04)
[2]大肠杆菌Fts Z蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定[J]. 陈云雨,牛夏忆,李淼,李霓,刘晓平.  生物工程学报. 2019(06)
[3]一种“高性价比”切胶纯化原核表达蛋白的方法[J]. 高慎阳,查恩辉,王珅,周铁忠,李慧.  中国农学通报. 2010(22)
[4]包涵体蛋白质的复性研究进展[J]. 张婷婷,叶波平.  药物生物技术. 2007(04)

博士论文
[1]NEK2在原发性肝细胞肝癌中的表达及对其生物学特性的影响[D]. 林双.浙江大学 2017

硕士论文
[1]淫羊藿苷单克隆抗体的制备及其ELISA法的建立和FLISA法的初探[D]. 成金俊.北京中医药大学 2015



本文编号：3131917