唾液酸酶异源表达、酶学性质以及其生物转化制备神经节苷脂GM1应用的研究
发布时间：2021-04-13 04:27
本研究构建了分泌表达唾液酸酶的重组枯草芽孢杆菌WB800N-pHT43-sia,优化了产酶条件,在TB培养基中,添加1 mM的诱导剂,30℃下诱导18 h后酶活最高,达到401 U/mL,比优化前酶活（192.8 U/mL）提高了2.1倍。利用生长细胞体系转化多唾液酸神经节苷脂（GLS）生产单唾液酸神经节苷脂（GM1）,10g/L的GLS在优化产酶后的生长细胞体系中转化2d后,GLS全部转化成GM1,GM1的浓度从初始的0.12 mg/mL增加到2.23 mg/mL,比优化前体系中GM1浓度提高了两倍多。研究了重组唾液酸酶的酶学性质,最适温度为37℃,最适pH为6.5,在pH 5.5-7.0的范围内酶活较稳定。唾液酸酶的Km值为0.15 mmol/L,Vmax为0.69μmol/min。唾液酸对唾液酸酶的抑制类型为竞争性抑制,抑制常数为0.15 mmol/L。将透析（一种在位分离技术）应用到游离酶催化GLS生产GM1的体系中,解除了唾液酸对唾液酸酶的抑制作用。50 g/L GLS,10000 U/mL酶量,12 h后GLS全部转化为GM1,GM1的含量从0.42 mg/mL增加到了10...
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．２细菌唾液酸酶结构图??Ｆｉｇ．?１．２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｂａｃｔｅｒｉａｌ?ｓｉａｌｉｄａｓｅｓ??
芽孢杆菌ＷＢ８００Ｎ菌株和质粒ｐＨＴ４３为华东理工大学鲁华生物技术研究所魏巍老师课??题组馈赠。ｐＨＴ４３质粒在本课题中用于构建枯草芽孢杆菌表达体系。ｃｏ／／??ＤＨ５ａ用于基因的克隆，ｐＨＴ４３质粒的质粒图谱和克隆表达区域见图２．１。??（ａ）??Ｘｈｏｌ??Ｃｆａ?Ｉ?？??＼?ｉ?一?Ｉ??ＳｅｘＡｉ??、?〇ＲＦ－２??ＡｍｐＲ＾ｌ??＾?ＯＲＦ－１?％??ＣｏｌＥ１?Ｂ??，?ｐＨＴ４３?等??Ｔ—Ａ＾ｌｌ??＼?８０５７?ｂｐ?１??％＾〇ＲＦ－３?ＣｍＲ?？；??Ａ??／?ｇｍｃ?、??／?＾Ｌａｃｌ?為Ｍｕｎ?１??ｓｍ；，?和?Ｓａｄ??＿?Ａｐａ＼??Ｘｂａ?Ｉ??Ｂａｍ?ｈｉ?Ｐｇｒａｃ：?Ｐｇｒａｃ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ?（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ?ｏｆ?ｔｈｅ??ｇｒｏＥ．?ｐｒｏｍｏｔｅｒ；?ｔｈｅ?／ａｃＯｏｐｅｒａｔｏｒａｎｄ?ｔｈｅ??ｇｓＢＳＤ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ）??ＣｏｌＥ?１?ｏｒｉ：?ＣｏｌＥ?１?ｏｒｉｇｉｎ??Ａｍｐ
调ｐＨ为７．５）?＝７０：?３０?（ｖ／ｖ）。高效液相色谱的检测条件为２０５?ｎｍ，?１?ｍＬ／ｍｉｎ，２５°Ｃ，??进样量为２０?｜ｉＬ。??ＧＭ１的标准曲线如下图２．２。??３００００?－１??２５０００?－?ｙ＝?５．４３３ｘ?＋?９０Ｊ２＾??Ｒ２＝?０．９９３０＾??２００００?－??Ｈ?１５０００?－??１００００?－??５０００?－??０??１?１?１?１?１?１??０?１０００?２０００?３０００?４０００?５０００?６０００??ＧＭ１?浓度（ｎｇ／ｍＬ）??图２．２?标准曲线??Ｆｉｇ．２．２?Ｔｈｅ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ＧＭ１??２．５实验结果??２．５．１唾液酸酶目的基因的扩增??以本实验室前期构建的大肠杆菌重组菌株五．ｃｏ／／?ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ－＾／中的目的??基因为模板，聚合酶链式反应ＰＣＲ进行扩增，由下图２．３看到扩增产物中有一条分??子大小约为３０００?ｂｐ的单一目的条带，它与唾液酸酶基因片段大小相同并将扩增出来的??ＤＮＡ送去公司测序，将测序结果与己知的唾液酸酶基因序列进行比对，序列一致，说明??成功的扩增得到唾液酸酶基因。??
【参考文献】：
期刊论文
[1]产唾液酸酶微生物的筛选及产酶条件的优化[J]. 曹丹,王学东,张鲁嘉,张建国,魏东芝. 生物加工过程. 2009(04)
[2]离子交换树脂处理含铬废水的研究[J]. 徐灵,王成端,姚岚. 工业安全与环保. 2007(11)
[3]以弱碱性树脂去除废水中5-氨基-2-氯甲苯-4-磺酸和盐酸:平衡及动力学[J]. 李长海. 化工学报. 2007(06)
[4]枯草杆菌表达系统的研究进展[J]. 彭清忠,张惟材,朱厚础. 生物技术通讯. 2001(03)
[5]气质联用分析黄酒中有机酸[J]. 宣栋梁,翟武. 现代预防医学. 2001(02)
[6]云南中草药鬼针草中微量砷的形态分析[J]. 王亮,陈莉莉,朱光辉,王光灿,尹家元. 微量元素与健康研究. 2000(01)
[7]口服液体控释给药系统研究进展[J]. 李振华,平其能,刘国杰. 药学进展. 1998(01)
[8]用膜技术解除螺旋霉素生物合成过程中产物的反馈抑制作用[J]. 李友荣,邹崇达. 中国抗生素杂志. 1992(01)
[9]短小芽孢杆菌作为芽孢杆菌属基因工程受体菌的研究[J]. 陈启民,耿运琪,倪津,王革伏,蒋如璋. 遗传学报. 1989(03)
[10]用中空纤维生物反应器发酵乳酸时细胞和乳酸浓度的控制[J]. 汪恩浩,畑中英孝,饭岛信司,竹林孝浩,史仲平,清水和幸,松原正一,小林猛. 工业微生物. 1989 (02)
本文编号：3134615
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．２细菌唾液酸酶结构图??Ｆｉｇ．?１．２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｂａｃｔｅｒｉａｌ?ｓｉａｌｉｄａｓｅｓ??
芽孢杆菌ＷＢ８００Ｎ菌株和质粒ｐＨＴ４３为华东理工大学鲁华生物技术研究所魏巍老师课??题组馈赠。ｐＨＴ４３质粒在本课题中用于构建枯草芽孢杆菌表达体系。ｃｏ／／??ＤＨ５ａ用于基因的克隆，ｐＨＴ４３质粒的质粒图谱和克隆表达区域见图２．１。??（ａ）??Ｘｈｏｌ??Ｃｆａ?Ｉ?？??＼?ｉ?一?Ｉ??ＳｅｘＡｉ??、?〇ＲＦ－２??ＡｍｐＲ＾ｌ??＾?ＯＲＦ－１?％??ＣｏｌＥ１?Ｂ??，?ｐＨＴ４３?等??Ｔ—Ａ＾ｌｌ??＼?８０５７?ｂｐ?１??％＾〇ＲＦ－３?ＣｍＲ?？；??Ａ??／?ｇｍｃ?、??／?＾Ｌａｃｌ?為Ｍｕｎ?１??ｓｍ；，?和?Ｓａｄ??＿?Ａｐａ＼??Ｘｂａ?Ｉ??Ｂａｍ?ｈｉ?Ｐｇｒａｃ：?Ｐｇｒａｃ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ?（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ?ｏｆ?ｔｈｅ??ｇｒｏＥ．?ｐｒｏｍｏｔｅｒ；?ｔｈｅ?／ａｃＯｏｐｅｒａｔｏｒａｎｄ?ｔｈｅ??ｇｓＢＳＤ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ）??ＣｏｌＥ?１?ｏｒｉ：?ＣｏｌＥ?１?ｏｒｉｇｉｎ??Ａｍｐ
调ｐＨ为７．５）?＝７０：?３０?（ｖ／ｖ）。高效液相色谱的检测条件为２０５?ｎｍ，?１?ｍＬ／ｍｉｎ，２５°Ｃ，??进样量为２０?｜ｉＬ。??ＧＭ１的标准曲线如下图２．２。??３００００?－１??２５０００?－?ｙ＝?５．４３３ｘ?＋?９０Ｊ２＾??Ｒ２＝?０．９９３０＾??２００００?－??Ｈ?１５０００?－??１００００?－??５０００?－??０??１?１?１?１?１?１??０?１０００?２０００?３０００?４０００?５０００?６０００??ＧＭ１?浓度（ｎｇ／ｍＬ）??图２．２?标准曲线??Ｆｉｇ．２．２?Ｔｈｅ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ＧＭ１??２．５实验结果??２．５．１唾液酸酶目的基因的扩增??以本实验室前期构建的大肠杆菌重组菌株五．ｃｏ／／?ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ－＾／中的目的??基因为模板，聚合酶链式反应ＰＣＲ进行扩增，由下图２．３看到扩增产物中有一条分??子大小约为３０００?ｂｐ的单一目的条带，它与唾液酸酶基因片段大小相同并将扩增出来的??ＤＮＡ送去公司测序，将测序结果与己知的唾液酸酶基因序列进行比对，序列一致，说明??成功的扩增得到唾液酸酶基因。??
【参考文献】：
期刊论文
[1]产唾液酸酶微生物的筛选及产酶条件的优化[J]. 曹丹,王学东,张鲁嘉,张建国,魏东芝. 生物加工过程. 2009(04)
[2]离子交换树脂处理含铬废水的研究[J]. 徐灵,王成端,姚岚. 工业安全与环保. 2007(11)
[3]以弱碱性树脂去除废水中5-氨基-2-氯甲苯-4-磺酸和盐酸:平衡及动力学[J]. 李长海. 化工学报. 2007(06)
[4]枯草杆菌表达系统的研究进展[J]. 彭清忠,张惟材,朱厚础. 生物技术通讯. 2001(03)
[5]气质联用分析黄酒中有机酸[J]. 宣栋梁,翟武. 现代预防医学. 2001(02)
[6]云南中草药鬼针草中微量砷的形态分析[J]. 王亮,陈莉莉,朱光辉,王光灿,尹家元. 微量元素与健康研究. 2000(01)
[7]口服液体控释给药系统研究进展[J]. 李振华,平其能,刘国杰. 药学进展. 1998(01)
[8]用膜技术解除螺旋霉素生物合成过程中产物的反馈抑制作用[J]. 李友荣,邹崇达. 中国抗生素杂志. 1992(01)
[9]短小芽孢杆菌作为芽孢杆菌属基因工程受体菌的研究[J]. 陈启民,耿运琪,倪津,王革伏,蒋如璋. 遗传学报. 1989(03)
[10]用中空纤维生物反应器发酵乳酸时细胞和乳酸浓度的控制[J]. 汪恩浩,畑中英孝,饭岛信司,竹林孝浩,史仲平,清水和幸,松原正一,小林猛. 工业微生物. 1989 (02)
本文编号：3134615
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3134615.html
