可有效提高链霉菌内源抗生素产量的“超级质粒”的构建及应用
发布时间：2021-07-04 06:26
微生物可产生丰富的次级代谢产物,这些产物在化学结构及生物活性方面具有丰富的多样性。其中以链霉菌为代表的放线菌,所产生的抗生素类活性产物占已知抗生素种类的70%以上。大多数野生型链霉菌抗生素的产量较低,无法满足工业化需求。本研究选择了将全局性调控因子afs R、环化腺苷酸受体蛋白基因crp、引入点突变的RNA聚合酶β亚基的编码基因（rpo B）及乙酰辅酶A羧化酶基因（acc A2BE）这四个具有显著上调链霉菌抗生素产量的元件,一起克隆到组成型强启动子Perm E*的下游,通过链霉菌整合型载体p SET152,将这些基因元件引入到不同的抗生素产生菌中进行超量表达,以期提高抗生素的产量。将构建好的“超级质粒”导入Streptomyces coelicolor M145中,将聚酮类化合物放线紫红素的产量提高到了野生型的2.019倍,十一烷基灵菌红素的产量提高到了野生型的2.816倍;导入吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus ATCC29253,将安莎类抗生素hygrocin A的产量提高到了野生型的2.634倍,雷帕霉素的产...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：129 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
基因表达多层次调控图(LeeYJ2018)
华中农业大学2020届博士研究生学位（毕业）论文6图1.2多效调节基因adpA的调节模型(Liuetal.2013)Figure1.2RegulationmodelofthepleiotropicregulatorygeneadpAS.lividans体内的Reg1，其N-末端含有一个螺旋-转角-螺旋的DNA结合位点。该蛋白分子与S.coelicolor中malE基因的抑制因子MalR具有95%的相似性；与S.limosus中α-淀粉酶的正向调控因子ORF-Sl的相似性为65%；同时也与Bacillussubtilis中碳代谢的抑制因子CcpA具有31%的相似性。在S.lividans中其能够影响α-淀粉酶的产量，同时还能够消除碳分解代谢过程中的抑制作用(Nguyenetal.1997)。降解物激活蛋白-环腺苷酸受体蛋白基因crp(cyclicadenosinemonophosphatereceptorprotein,CRP)也是一种全局性转录调控因子(Derouauxetal.2004;Espertetal.2011)。最初是在Escherichiacoli中发现的该调控因子，与其效应分子cAMP一起介导大肠杆菌中的碳代谢(Yanetal.2015)。Crp调控因子介导于链霉菌的初级和次级代谢过程中(Derouauxetal.2004;Pietteetal.2005;Gaoetal.2012)。Crp可以为次级代谢提供前体物质和辅助因子，还能促进生物合成基因簇表达增加，从而直接或间接控制次级代谢。此外，tarA(Engeletal.2001)、crpA(Onakaetal.1998)和spbR(Folcheretal.2001)等都属于链霉菌体内的多效调节因子。
华中农业大学2020届博士研究生学位（毕业）论文8环境中的信号与含有α-螺旋的感应因子的N-末端相结合，在ATP的帮助下，磷酸化的激酶蛋白将感应因子的组氨基酸残基磷酸化，导致相应的构象发生变化。随后应答调节蛋白N末端上的氨基酸残基会接收到磷酸化的激酶蛋白提供的磷酰基，最终使应答调节蛋白发生磷酸化而活化，当被磷酸化的应答因子结合到靶基因的启动子上，最终使目标基因的转录被抑制或者激活。。图1.3典型的双组份系统的信号传导模式图(Hoch2000)Figure1.3Signalingpatterndiagramofatypicaltwo-componentsystem原核生物体内普遍存在着双组分调控体系，这也是生物细胞中最常见的信号转导途径之一。该系统控制着生物类群细菌的趋化性、孢子的形成、渗透压和次级代谢物质的合成等大多数生理过程。双组分调控系统（TCSs）在链霉菌中存在着两种能够调控次级代谢产物的激酶超家族：一种是丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶家族，这类家族通过级联效应来影响链霉菌的次级代谢，例如外部环境引起的蛋白激酶的磷酸化和脱磷酸化；另一种类型是组氨酸激酶家族，这一类家族由两个蛋白组成，一个是磷酸化供体-组氨酸激酶蛋白（HK），跨膜蛋白HK由感应域、发送域和ATP酶域三个功能结构域组成。另一种是磷酸化受体-应答调节蛋白（RR），RRs含有两个区域：接收区和效应区，属于这一类家族的调控系统如：cutR/cutS(Tanakaetal.2007)、afsQ1/afsQ2(Ishizukaetal.1992)、ecrA1/ecrA2(Huangetal.2001)等。AfsR/afsK是链霉菌中发现的第一个真核类的双组份调控系统(Umeyamaetal.2002)，属于典型的丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶家族(Tanakaetal.2007)。其调控机制如下图所示（图1.4）(Horinouchi2003)，AfsK是一种蛋白激酶，其与膜的内侧相
【参考文献】：
期刊论文
[1]龟裂链霉菌M527接合转移体系的建立和优化以及启动子的活性分析（英文）[J]. Zhang-qing SONG,Zhi-jun LIAO,Ye-feng HU,Zheng MA,Andreas BECHTHOLD,Xiao-ping YU. Journal of Zhejiang University-Science B（Biomedicine & Biotechnology）. 2019(11)
[2]Comparative analysis of rapamycin biosynthesis clusters between Actinoplanes sp. N902-109 and Streptomyces hygroscopicus ATCC29253[J]. HUANG He,REN Shuang-Xi,YANG Sheng,HU Hai-Feng. Chinese Journal of Natural Medicines. 2015(02)
[3]链霉菌负调控因子突变筛选系统的构建[J]. 朱宇,冯迟,谭华荣,田宇清. 微生物学报. 2013(10)
[4]luxAB发光基因标记的铜绿假单胞菌株的构建[J]. 李闻,刘红艳,黄正. 卫生研究. 2011(01)
本文编号：3264228
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：129 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
基因表达多层次调控图(LeeYJ2018)
华中农业大学2020届博士研究生学位（毕业）论文6图1.2多效调节基因adpA的调节模型(Liuetal.2013)Figure1.2RegulationmodelofthepleiotropicregulatorygeneadpAS.lividans体内的Reg1，其N-末端含有一个螺旋-转角-螺旋的DNA结合位点。该蛋白分子与S.coelicolor中malE基因的抑制因子MalR具有95%的相似性；与S.limosus中α-淀粉酶的正向调控因子ORF-Sl的相似性为65%；同时也与Bacillussubtilis中碳代谢的抑制因子CcpA具有31%的相似性。在S.lividans中其能够影响α-淀粉酶的产量，同时还能够消除碳分解代谢过程中的抑制作用(Nguyenetal.1997)。降解物激活蛋白-环腺苷酸受体蛋白基因crp(cyclicadenosinemonophosphatereceptorprotein,CRP)也是一种全局性转录调控因子(Derouauxetal.2004;Espertetal.2011)。最初是在Escherichiacoli中发现的该调控因子，与其效应分子cAMP一起介导大肠杆菌中的碳代谢(Yanetal.2015)。Crp调控因子介导于链霉菌的初级和次级代谢过程中(Derouauxetal.2004;Pietteetal.2005;Gaoetal.2012)。Crp可以为次级代谢提供前体物质和辅助因子，还能促进生物合成基因簇表达增加，从而直接或间接控制次级代谢。此外，tarA(Engeletal.2001)、crpA(Onakaetal.1998)和spbR(Folcheretal.2001)等都属于链霉菌体内的多效调节因子。
华中农业大学2020届博士研究生学位（毕业）论文8环境中的信号与含有α-螺旋的感应因子的N-末端相结合，在ATP的帮助下，磷酸化的激酶蛋白将感应因子的组氨基酸残基磷酸化，导致相应的构象发生变化。随后应答调节蛋白N末端上的氨基酸残基会接收到磷酸化的激酶蛋白提供的磷酰基，最终使应答调节蛋白发生磷酸化而活化，当被磷酸化的应答因子结合到靶基因的启动子上，最终使目标基因的转录被抑制或者激活。。图1.3典型的双组份系统的信号传导模式图(Hoch2000)Figure1.3Signalingpatterndiagramofatypicaltwo-componentsystem原核生物体内普遍存在着双组分调控体系，这也是生物细胞中最常见的信号转导途径之一。该系统控制着生物类群细菌的趋化性、孢子的形成、渗透压和次级代谢物质的合成等大多数生理过程。双组分调控系统（TCSs）在链霉菌中存在着两种能够调控次级代谢产物的激酶超家族：一种是丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶家族，这类家族通过级联效应来影响链霉菌的次级代谢，例如外部环境引起的蛋白激酶的磷酸化和脱磷酸化；另一种类型是组氨酸激酶家族，这一类家族由两个蛋白组成，一个是磷酸化供体-组氨酸激酶蛋白（HK），跨膜蛋白HK由感应域、发送域和ATP酶域三个功能结构域组成。另一种是磷酸化受体-应答调节蛋白（RR），RRs含有两个区域：接收区和效应区，属于这一类家族的调控系统如：cutR/cutS(Tanakaetal.2007)、afsQ1/afsQ2(Ishizukaetal.1992)、ecrA1/ecrA2(Huangetal.2001)等。AfsR/afsK是链霉菌中发现的第一个真核类的双组份调控系统(Umeyamaetal.2002)，属于典型的丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶家族(Tanakaetal.2007)。其调控机制如下图所示（图1.4）(Horinouchi2003)，AfsK是一种蛋白激酶，其与膜的内侧相
【参考文献】：
期刊论文
[1]龟裂链霉菌M527接合转移体系的建立和优化以及启动子的活性分析（英文）[J]. Zhang-qing SONG,Zhi-jun LIAO,Ye-feng HU,Zheng MA,Andreas BECHTHOLD,Xiao-ping YU. Journal of Zhejiang University-Science B（Biomedicine & Biotechnology）. 2019(11)
[2]Comparative analysis of rapamycin biosynthesis clusters between Actinoplanes sp. N902-109 and Streptomyces hygroscopicus ATCC29253[J]. HUANG He,REN Shuang-Xi,YANG Sheng,HU Hai-Feng. Chinese Journal of Natural Medicines. 2015(02)
[3]链霉菌负调控因子突变筛选系统的构建[J]. 朱宇,冯迟,谭华荣,田宇清. 微生物学报. 2013(10)
[4]luxAB发光基因标记的铜绿假单胞菌株的构建[J]. 李闻,刘红艳,黄正. 卫生研究. 2011(01)
本文编号：3264228
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