基于DNA银簇的等温信号放大检测方法研究进展
发布时间：2021-07-07 12:00
本文介绍了包括链置换扩增法、滚环扩增法、环介导等温扩增技术以及工具酶法在内的等温信号放大检测方法,并详细阐述了链置换扩增法和环介导等温扩增技术的原理、一种进行三重信号放大的新型滚环扩增策略以及脱氧核糖转移酶催化的新型生物条形码放大技术,并例举了一些以DNA银簇为免标记信号的等温放大检测方法的设计策略,对免标记信号的优点以及DNA银簇的研究价值进行了总结和展望.
【文章来源】：分子科学学报. 2020,36(02)北大核心
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
SDA原理和RCA三重信号放大原理
如图1b所示,文献[7]设计了一种基于RCA的高灵敏端粒酶荧光检测方法,端粒酶可以在染色体DNA端粒末端添加(TTAGGG)n的重复序列,大量的(TTAGGG)重复序列被不断地连接到引物的3"端,形成长链ssDNA;有AP位点(无嘌呤/嘧啶位点)并被—NH2修饰的辅助探针与ssDNA杂交并被特异性的AP内切酶剪切,生成含3"—OH端的新DNA引物进一步与环状模板杂交并启动RCA过程,最后含AP位点的荧光标记探针与RCA产物结合并产生荧光信号,该三重信号放大检测方法具有超高灵敏度,可测到1个Hela细胞中的端粒酶活性.文献[8]设计了基于RCA的检测5-羟甲基胞嘧啶DNA(5hmC-DNA)高灵敏性免标记荧光检测方法,引物DNA中的5hmC与KRuO4反应后,在碱性条件下被亚硫酸盐氧化生成尿嘧啶(U),进而与含腺嘌呤(A)碱基的RCA模板互补,在连接酶和聚合酶共同作用下,启动RCA,实现信号放大检测,方法的检测限低至34.8×10-15 mol·L-1.LAMP是基于Bst DNA聚合酶开发的高灵敏高特异性的核酸扩增技术[9],如图2所示,巧妙设计的含互补序列的可形成环结构的引物是LAMP设计的关键,这使得其能够进行非退火结合.Bst DNA聚合酶具有强的链置换活性,能够沿模板进行聚合,延长引物并在新引物合成过程中替换上一条链,产生DNA扩增输出,整个过程不需要繁琐的热循环,可以在不到1 h内产生超过109份新链.此外,由于在引物上使用6个不同的探测序列,基于LAMP技术的检测方法表现出比PCR方法更高的特异性.等温信号放大检测方法除借助上述熟知的扩增技术以外,还可通过设计工具酶辅助的循环放大策略,实现信号放大检测.分子生物学中许多有特异活性的工具酶,如核酸外切酶1(Exo Ⅰ)[10]、核酸外切酶3(Exo Ⅲ)[11]、λ外切酶(λexo)[12]、脱氧核糖核酸酶(DNase I)[13]、限制性内切酶(NEase)[14]、聚合酶(Polymerase)[15]、连接酶(Ligase)[16]和核糖核酸酶H(RNase H)[17]等分别被用于设计不同的循环放大策略,构建荧光、比色和电化学等高灵敏检测方法.如以miRNA为检测对象,基于聚集诱导发光现象,构建了Exo Ⅲ辅助循环放大荧光检测方法[18],检测限达到了1.0×10-17 (4 ℃)和1.0×10-12 mol·L-1 (37 ℃),并成功应用于膀胱癌病人尿液中的miRNA检测.使用硫堇标记的DNA探针和丝网印刷碳电极,基于氧化石墨烯对ssDNA的吸附作用和酶切保护作用,构建的基于DNase I辅助循环放大策略的电化学检测方法[19],对食品中赭曲霉素A的检测限低至5.6×10-12 g·mL-1.以腺苷为检测对象,使用FAM荧光染料标记的DNA探针和二维纳米材料氧化石墨烯,构建的基于适配体-配体相互作用的Exo I辅助循环放大高灵敏荧光检测方法[20],相比非酶辅方法(检测限21.2 ×10-6 mol·L-1)的检测限低至3.1×10-6 mol·L-1.以三磷酸腺苷(ATP)为检测对象,使用巯基和亚甲基蓝修饰的DNA探针,基于适配体-配体结合诱导构象变化,构建的Nb.BbvCl辅助放大电化学检测方法[21],ATP的线性区间为1.0×10-8～1.0×10-6 mol·L-1,检测限低至3.4×10-9 mol·L-1.文献[22]发展了一种无需DNA模板,只需要借助末端脱氧核糖转移酶(TDT)催化延伸的生物条形码放大技术(BCA),该信号放大技术包含2个重要部分,即带有寡核糖核苷酸的磁球和表面分别修饰富A碱基A-DNA及富鸟嘌呤(G)碱基的信号G-DNA的纳米金.在TDT的催化下寡核糖核苷酸延伸,产生富含胸腺嘧啶(T)碱基序列的ssDNA与A-DNA杂交,随后G-DNA在TDT的催化下延伸,形成富G四链体结构的长链并与氯化血红素辅助因子结合,催化过氧化氢介导的鲁米诺氧化反应生成强荧光信号.基于BCA技术的检测方法显示出超高效率,且检测限低至5.0×10-19 mol·L-1.
核酸扩增技术与基于工具酶的循环放大策略各有优缺点,具体选择哪一种取决于检测对象和信号输出的方式.基于核酸扩增技术的信号放大检测方法信号输出一般是从弱到强、从无到有;基于工具酶的放大检测方法信号输出一般是从抑制到回复.但是从最近的文献来看,往往是同时采用核酸扩增技术和工具酶辅助循环放大策略,实现超高灵敏检测.2 以DNA银簇为免标记输出信号的检测方法
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于链置换扩增反应与DNA银簇的免标记核酸检测方法[J]. 张瑶,成玉梁,谢云飞,姚卫蓉,郭亚辉,钱和. 武汉大学学报(理学版). 2018(04)
本文编号：3269593
【文章来源】：分子科学学报. 2020,36(02)北大核心
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
SDA原理和RCA三重信号放大原理
如图1b所示,文献[7]设计了一种基于RCA的高灵敏端粒酶荧光检测方法,端粒酶可以在染色体DNA端粒末端添加(TTAGGG)n的重复序列,大量的(TTAGGG)重复序列被不断地连接到引物的3"端,形成长链ssDNA;有AP位点(无嘌呤/嘧啶位点)并被—NH2修饰的辅助探针与ssDNA杂交并被特异性的AP内切酶剪切,生成含3"—OH端的新DNA引物进一步与环状模板杂交并启动RCA过程,最后含AP位点的荧光标记探针与RCA产物结合并产生荧光信号,该三重信号放大检测方法具有超高灵敏度,可测到1个Hela细胞中的端粒酶活性.文献[8]设计了基于RCA的检测5-羟甲基胞嘧啶DNA(5hmC-DNA)高灵敏性免标记荧光检测方法,引物DNA中的5hmC与KRuO4反应后,在碱性条件下被亚硫酸盐氧化生成尿嘧啶(U),进而与含腺嘌呤(A)碱基的RCA模板互补,在连接酶和聚合酶共同作用下,启动RCA,实现信号放大检测,方法的检测限低至34.8×10-15 mol·L-1.LAMP是基于Bst DNA聚合酶开发的高灵敏高特异性的核酸扩增技术[9],如图2所示,巧妙设计的含互补序列的可形成环结构的引物是LAMP设计的关键,这使得其能够进行非退火结合.Bst DNA聚合酶具有强的链置换活性,能够沿模板进行聚合,延长引物并在新引物合成过程中替换上一条链,产生DNA扩增输出,整个过程不需要繁琐的热循环,可以在不到1 h内产生超过109份新链.此外,由于在引物上使用6个不同的探测序列,基于LAMP技术的检测方法表现出比PCR方法更高的特异性.等温信号放大检测方法除借助上述熟知的扩增技术以外,还可通过设计工具酶辅助的循环放大策略,实现信号放大检测.分子生物学中许多有特异活性的工具酶,如核酸外切酶1(Exo Ⅰ)[10]、核酸外切酶3(Exo Ⅲ)[11]、λ外切酶(λexo)[12]、脱氧核糖核酸酶(DNase I)[13]、限制性内切酶(NEase)[14]、聚合酶(Polymerase)[15]、连接酶(Ligase)[16]和核糖核酸酶H(RNase H)[17]等分别被用于设计不同的循环放大策略,构建荧光、比色和电化学等高灵敏检测方法.如以miRNA为检测对象,基于聚集诱导发光现象,构建了Exo Ⅲ辅助循环放大荧光检测方法[18],检测限达到了1.0×10-17 (4 ℃)和1.0×10-12 mol·L-1 (37 ℃),并成功应用于膀胱癌病人尿液中的miRNA检测.使用硫堇标记的DNA探针和丝网印刷碳电极,基于氧化石墨烯对ssDNA的吸附作用和酶切保护作用,构建的基于DNase I辅助循环放大策略的电化学检测方法[19],对食品中赭曲霉素A的检测限低至5.6×10-12 g·mL-1.以腺苷为检测对象,使用FAM荧光染料标记的DNA探针和二维纳米材料氧化石墨烯,构建的基于适配体-配体相互作用的Exo I辅助循环放大高灵敏荧光检测方法[20],相比非酶辅方法(检测限21.2 ×10-6 mol·L-1)的检测限低至3.1×10-6 mol·L-1.以三磷酸腺苷(ATP)为检测对象,使用巯基和亚甲基蓝修饰的DNA探针,基于适配体-配体结合诱导构象变化,构建的Nb.BbvCl辅助放大电化学检测方法[21],ATP的线性区间为1.0×10-8～1.0×10-6 mol·L-1,检测限低至3.4×10-9 mol·L-1.文献[22]发展了一种无需DNA模板,只需要借助末端脱氧核糖转移酶(TDT)催化延伸的生物条形码放大技术(BCA),该信号放大技术包含2个重要部分,即带有寡核糖核苷酸的磁球和表面分别修饰富A碱基A-DNA及富鸟嘌呤(G)碱基的信号G-DNA的纳米金.在TDT的催化下寡核糖核苷酸延伸,产生富含胸腺嘧啶(T)碱基序列的ssDNA与A-DNA杂交,随后G-DNA在TDT的催化下延伸,形成富G四链体结构的长链并与氯化血红素辅助因子结合,催化过氧化氢介导的鲁米诺氧化反应生成强荧光信号.基于BCA技术的检测方法显示出超高效率,且检测限低至5.0×10-19 mol·L-1.
核酸扩增技术与基于工具酶的循环放大策略各有优缺点,具体选择哪一种取决于检测对象和信号输出的方式.基于核酸扩增技术的信号放大检测方法信号输出一般是从弱到强、从无到有;基于工具酶的放大检测方法信号输出一般是从抑制到回复.但是从最近的文献来看,往往是同时采用核酸扩增技术和工具酶辅助循环放大策略,实现超高灵敏检测.2 以DNA银簇为免标记输出信号的检测方法
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于链置换扩增反应与DNA银簇的免标记核酸检测方法[J]. 张瑶,成玉梁,谢云飞,姚卫蓉,郭亚辉,钱和. 武汉大学学报(理学版). 2018(04)
本文编号：3269593
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