OCT4通过紧密连接通路影响人毛囊间充质干细胞红系造血的机制研究
发布时间：2021-08-03 04:38
目的:检测细胞形态、大小、粘附性的改变,对不同细胞亚型的转录组进行测序,富集分析差异表达基因的功能,并分析OCT4下游靶基因的表达及功能,揭示人毛囊间充质干细胞（human hair follicle mesenchymal stem cell,hHFMSC）中形态与粘附、多潜能性和造血之间的关联,阐明OCT4重编程的hHFMSC中红细胞生成的可能分子机制,为体外生成红细胞的研究提供新的思路。方法:①在细胞培养过程中收集含有悬浮细胞的上层培养液并离心,以分离贴壁细胞与悬浮细胞,于相差显微镜及荧光显微镜下观察细胞形态。②利用流式细胞术检测细胞前向散射,比较细胞的相对大小;通过细胞分离实验和细胞粘附实验分别检测细胞-细胞、细胞-细胞外基质粘附力的相对大小。③用RNA测序技术分析各组细胞转录本的差异并筛选差异表达基因（differentially expressed gene,DEG）,同时结合文献筛查OCT4下游靶基因的表达情况。④通过GO功能富集及KEGG信号通路富集计算,分析DEG的生物功能,并根据KEGG数据库注释TJ信号通路中的DEG。⑤qPCR和Western blot验证TJ通...
【文章来源】：青岛大学山东省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
OCT4转导后hHFMSC的形态变化
实验结果151.2细胞体积检测当细胞融合达70%-80%，分别收集hHFMSC、hHFMSCOCT4-adherent和hHFMSCOCT4-floating，利用流式细胞术检测FSC，用于比较细胞相对大校数据显示（图1.2），hHFMSCOCT4-adherent的体积明显小于hHFMSC，而hHFMSCOCT4-floating相较于hHFMSCOCT4-adherent体积更小，与镜下观察到的细胞形态改变一致。表明OCT4过表达使细胞大小发生变化。图1.2OCT4转导后hHFMSC的体积变化流式细胞术检测FSC，比较细胞的相对体积大校（**，P0.01；***，P0.001）1.3细胞粘附性检测利用细胞分离实验和细胞粘附实验，检测各组细胞的粘附性差异（图1.3）。细胞分离实验中，hHFMSCOCT4-adherent的单细胞百分比为47.5%，高于hHFMSC（9.4%），而hHFMSCOCT4-floating的单细胞百分比为85%，明显高于hHFMSCOCT4-adherent与hHFMSC。在细胞粘附实验中，hHFMSC、hHFMSCOCT4-adherent和hHFMSCOCT4-floating在培养板底面上贴附的细胞百分比分别为70.9%、18.4%和2.3%，说明hHFMSCOCT4-floating与基质的贴附率显著低于hHFMSC及hHFMSCOCT4-adherent。以上结果表明，转导OCT4后细胞粘附性显著降低，并且与贴壁细胞相比，悬浮细胞的粘附性更低。
青岛大学硕士学位论文16图1.3OCT4转导后hHFMSC的粘附性变化细胞分离实验与细胞粘附实验分别检测细胞-细胞粘附性、细胞-细胞外基质粘附性。（*，P0.05；**，P0.01；***，P0.001；****，P0.0001）综上，转导OCT4使hHFMSC形态、大小及粘附性均发生显著变化，并以hHFMSCOCT4-floating的形态最接近圆形，体积相对最小，粘附性最低，证明单因子OCT4可能对hHFMSC的基因组进行了重编程，并改变细胞形态学及生长方式。2.转导OCT4改变hHFMSC的基因转录本2.1主成分分析为了探索OCT4如何影响hHFMSC的细胞形态及粘附性，以及这种改变是否在体外诱导hHFMSCOCT4生成红细胞过程中发挥作用，我们提取三组细胞的总RNA并进行转录组测序。首先，为验证各组内样本的相似度及组间样本的差异性，进行PCA分析，如PCA的二维分布图（图2.1A）及三维分布图所示（图2.1B），各组内三个细胞样本的距离相对较近，形成相对独立的群集，表明各组细胞样本具有良好的重复性；另一方面，各组样本之间的距离相对较远，表明其基因转录
本文编号：3318947
【文章来源】：青岛大学山东省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
OCT4转导后hHFMSC的形态变化
实验结果151.2细胞体积检测当细胞融合达70%-80%，分别收集hHFMSC、hHFMSCOCT4-adherent和hHFMSCOCT4-floating，利用流式细胞术检测FSC，用于比较细胞相对大校数据显示（图1.2），hHFMSCOCT4-adherent的体积明显小于hHFMSC，而hHFMSCOCT4-floating相较于hHFMSCOCT4-adherent体积更小，与镜下观察到的细胞形态改变一致。表明OCT4过表达使细胞大小发生变化。图1.2OCT4转导后hHFMSC的体积变化流式细胞术检测FSC，比较细胞的相对体积大校（**，P0.01；***，P0.001）1.3细胞粘附性检测利用细胞分离实验和细胞粘附实验，检测各组细胞的粘附性差异（图1.3）。细胞分离实验中，hHFMSCOCT4-adherent的单细胞百分比为47.5%，高于hHFMSC（9.4%），而hHFMSCOCT4-floating的单细胞百分比为85%，明显高于hHFMSCOCT4-adherent与hHFMSC。在细胞粘附实验中，hHFMSC、hHFMSCOCT4-adherent和hHFMSCOCT4-floating在培养板底面上贴附的细胞百分比分别为70.9%、18.4%和2.3%，说明hHFMSCOCT4-floating与基质的贴附率显著低于hHFMSC及hHFMSCOCT4-adherent。以上结果表明，转导OCT4后细胞粘附性显著降低，并且与贴壁细胞相比，悬浮细胞的粘附性更低。
青岛大学硕士学位论文16图1.3OCT4转导后hHFMSC的粘附性变化细胞分离实验与细胞粘附实验分别检测细胞-细胞粘附性、细胞-细胞外基质粘附性。（*，P0.05；**，P0.01；***，P0.001；****，P0.0001）综上，转导OCT4使hHFMSC形态、大小及粘附性均发生显著变化，并以hHFMSCOCT4-floating的形态最接近圆形，体积相对最小，粘附性最低，证明单因子OCT4可能对hHFMSC的基因组进行了重编程，并改变细胞形态学及生长方式。2.转导OCT4改变hHFMSC的基因转录本2.1主成分分析为了探索OCT4如何影响hHFMSC的细胞形态及粘附性，以及这种改变是否在体外诱导hHFMSCOCT4生成红细胞过程中发挥作用，我们提取三组细胞的总RNA并进行转录组测序。首先，为验证各组内样本的相似度及组间样本的差异性，进行PCA分析，如PCA的二维分布图（图2.1A）及三维分布图所示（图2.1B），各组内三个细胞样本的距离相对较近，形成相对独立的群集，表明各组细胞样本具有良好的重复性；另一方面，各组样本之间的距离相对较远，表明其基因转录
本文编号：3318947
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