Whi2调节酵母细胞自噬机制的研究
发布时间：2021-08-03 05:12
目的:研究酵母细胞中Whi2蛋白对自噬的调控机制。方法:通过同源重组法构建基因缺陷型酵母菌株,通过转入特定质粒过表达相关蛋白。利用prATG8-GFP质粒检测特定营养条件下细胞内自噬基因ATG8的转录水平,并通过蛋白免疫印迹显示GFP的表达量间接反应细胞内自噬诱导的水平。利用prATG8-GFP-ATG8质粒检测低浓度亮氨酸条件下细胞内自噬流水平,游离GFP占GFP表达总量（游离GFP与GFP-Atg8融合蛋白的总和）的比值即可反应细胞内自噬流的水平。并根据基因上位性分析法对结果进行分析,构建信号通路。结果:通过prATG8-GFP-ATG8质粒检测细胞内自噬流水平发现,无论是低浓度亮氨酸条件下还是无氮源的条件下,△whi2中GFP-Atg8的表达量都明显比WT中少。分别在WT和△whi2中敲除PEP4抑制自噬小体的降解过程,△whi2△pep4与△pep4相比,细胞内GFP-Atg8的表达量也明显降低。同时,通过prATG8-GFP质粒检测到Awhi2 WT中ATG8转录水平低,△whi2△pep4中ATG8转录水平比△pep4低。PKA对自噬诱导和自噬流水平有抑制作用,在△whi2...
【文章来源】：苏州大学江苏省 211工程院校
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．?Ｗｈｉ２、ＴＯＲＣｌ与自噬的关系（Ａ）在低浓度亮氨酸条件下，Ｗｈｉ２通过抑制Ｔ０ＲＣ１??激活自噬流，并通过独立于Ｔ０ＲＣ１的机制诱导自噬
前言?Ｗｈｉ２调节酵母细胞自噬的机制研究??Ｒａｓ２?ｇｌｕｃｏｓｅ??ｉ??ＡＣ?ｖ??ｆ?今〉ｃＡＭＰ?Ｉ??Ｐｄｅ２??ＡＴＰ?〇〇??广〇??＇?ｉｎａｃｔｉｖｅ??Ｂｃｙ１?Ｔｐｋ１－３??ａｃｔｉｖｅ??Ｂｃｙ１?Ｔｐｋ１－３??１?Ｒｉｍ１５??Ｐ．??Ａｔｇ１３?＾?Ｍｓｎ２?Ｍｓｎ４?Ｉ?Ｕｍｅ６??〇－??Ａｕｔｏｐｈａｇｙ?ｆｌｕｘ?ＡＴＧ８?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ??图２．?ＰＫＡ信号通路及其对自噬的调控机制??４．酵母Ｗｈｉ２蛋白及其人类同源蛋白ＫＣＴＤ１１??早在１９８０年，科学家在筛选调控细胞周期的基因时就鉴别出了酵母细胞中的??ｆＴ／／／２［２２］。在营养匮乏的条件下，野生型Ｗｈｉ２可以阻止细胞进入下一生长周期。在??基因突变体中，细胞周期蛋白Ｇｌｎｌ及Ｇｌｎ２的转录受到阻碍［２３，２４］，因此，即使??在营养匮乏的条件下，灰Ｈ７２基因突变的菌株仍然不能停止分裂［２５＿２７］。，同时，ＰＦ／／／２??的缺失会引起复制周期的缩短，异常激活Ｒａｓ－ｃＡＭＰ－ＰＫＡ通路，导致细胞在分裂过??程中发生肌动蛋白聚集、线粒体功能障碍、活性氧的积累、细胞活力下降以及肌动蛋??白骨架紊乱现象［２８，２９］。??已知Ｗｈｉ２蛋白在一般应激反应途径中起作用，Ｗｈｉ２与Ｐｓｒｌｐ和Ｐｓｒ２ｐ发生物理??相互作用，且依赖Ｐｓｒｌ／Ｐｓｒ２对环境压力做出反馈［３ｅ］。同时，Ｗｈｉ２也依赖Ｐｓｒｌ、Ｐｓｒ２??参与自嗤的调控。如前所述，在低浓度亮氨酸条件下，Ｗｈｉ２依赖Ｐｓｒｌ／Ｐｓｒ２且独立于??ＳＥＡＣＩＴ－Ｇｔｒ通路抑制Ｔ０ＲＣ１活性从而激活自噬流，并且通过独立于Ｔ０ＲＣ１的机制?
＞?ｎ．ｓ－－丨?Ｄ?，?＊?＊?Ｗｈ??Ｓ８Ｗ＇?ｉ内?＿?呈?ｌ５＿?…?Ｄ５ｈ??２?６０＾?■?ｒｆｉ?Ｉ?Ｉ?ｔ?１?ｒｆｉ??２?ｓ；?＆?１０?？?Ｉ?１?＾?Ｎ?Ｔ??４０％?■?Ｉ?．?７?Ｔ?ｒｉ－｜?Ｉ?ｒｈ?｜?Ｏ?丨?＊＊＊?｜?園??ｒｉｉｕｕｕ?ｏｉｏ?ｕｕｕ?ｗｉｗ?１?ｌ〇ｑ?ｊｏ??ＷＴ?＾ｗｈｉ２?ＷＴ?＼ｗｈｉ２?ＷＴ?＼ｗｈｉ２?ＷＴ?＼ｗｈｉ２??１０％?Ｌｅｕ?ＹＮＢ?１０％Ｌｅｕ?ＹＮＢ??图３．?Ａｗ／ｉ／２比ＷＴ中自噬流水平低（Ａ）分别向ＷＴ和Ａｗ／ｚ／２中转入??质粒，检测低浓度亮氨酸（ＣＳＨ－ＵＲＡ１０％Ｌｅｕ）和去除氮源（ＹＮＢ）的条件下菌株中??自噻通量的水平。（Ｂ）统计在低浓度亮氨酸条件下和减去氮源的条件下，ＷＴ和ＡｗＡ／２??中游离ＧＦＰ的量占ＧＦＰ表达总量（游离ＧＦＰ和ＧＦＰ－Ａｔｇ８融合蛋白的总和）的比值，??ｎ＝３。（Ｃ）以Ｐｇｋｌ蛋白为内参，以ＷＴ中Ｏｈ时ＧＦＰ的表达量为标准值，分别对低??浓度亮氨酸条件和去除氮源的条件下ＷＴ、ＡｗＡ／２中游离ＧＦＰ的水平进行定量，ｎ＝３。??定量结果均通过双尾ｔ检验进行差异性分析，误差线为标准方差；＊Ｐ＜０．０５，??＊＊０．０１＜Ｐ＜０．０２，?＊＊＊Ｐ＜０．０１具有统计学意义；ｎ．ｓ．，无统计学意义。??然而，无论在低浓度亮氨酸条件下还是去除氮源的条件下，Ａｗ／ｎ＿２中游离ＧＦＰ??的水平均低于ＷＴ中游离ＧＦＰ的水平（图３Ａ，?１Ｃ）。那么，与ＷＴ相比，究竟是ｚＷＡ／２??中乂ＴＯＳ本身的诱导水平比低还是因为蛋白降解速度比较快导致细胞中Ａｔｇ８的水平??比较低？为了进
本文编号：3319005
【文章来源】：苏州大学江苏省 211工程院校
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．?Ｗｈｉ２、ＴＯＲＣｌ与自噬的关系（Ａ）在低浓度亮氨酸条件下，Ｗｈｉ２通过抑制Ｔ０ＲＣ１??激活自噬流，并通过独立于Ｔ０ＲＣ１的机制诱导自噬
前言?Ｗｈｉ２调节酵母细胞自噬的机制研究??Ｒａｓ２?ｇｌｕｃｏｓｅ??ｉ??ＡＣ?ｖ??ｆ?今〉ｃＡＭＰ?Ｉ??Ｐｄｅ２??ＡＴＰ?〇〇??广〇??＇?ｉｎａｃｔｉｖｅ??Ｂｃｙ１?Ｔｐｋ１－３??ａｃｔｉｖｅ??Ｂｃｙ１?Ｔｐｋ１－３??１?Ｒｉｍ１５??Ｐ．??Ａｔｇ１３?＾?Ｍｓｎ２?Ｍｓｎ４?Ｉ?Ｕｍｅ６??〇－??Ａｕｔｏｐｈａｇｙ?ｆｌｕｘ?ＡＴＧ８?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ??图２．?ＰＫＡ信号通路及其对自噬的调控机制??４．酵母Ｗｈｉ２蛋白及其人类同源蛋白ＫＣＴＤ１１??早在１９８０年，科学家在筛选调控细胞周期的基因时就鉴别出了酵母细胞中的??ｆＴ／／／２［２２］。在营养匮乏的条件下，野生型Ｗｈｉ２可以阻止细胞进入下一生长周期。在??基因突变体中，细胞周期蛋白Ｇｌｎｌ及Ｇｌｎ２的转录受到阻碍［２３，２４］，因此，即使??在营养匮乏的条件下，灰Ｈ７２基因突变的菌株仍然不能停止分裂［２５＿２７］。，同时，ＰＦ／／／２??的缺失会引起复制周期的缩短，异常激活Ｒａｓ－ｃＡＭＰ－ＰＫＡ通路，导致细胞在分裂过??程中发生肌动蛋白聚集、线粒体功能障碍、活性氧的积累、细胞活力下降以及肌动蛋??白骨架紊乱现象［２８，２９］。??已知Ｗｈｉ２蛋白在一般应激反应途径中起作用，Ｗｈｉ２与Ｐｓｒｌｐ和Ｐｓｒ２ｐ发生物理??相互作用，且依赖Ｐｓｒｌ／Ｐｓｒ２对环境压力做出反馈［３ｅ］。同时，Ｗｈｉ２也依赖Ｐｓｒｌ、Ｐｓｒ２??参与自嗤的调控。如前所述，在低浓度亮氨酸条件下，Ｗｈｉ２依赖Ｐｓｒｌ／Ｐｓｒ２且独立于??ＳＥＡＣＩＴ－Ｇｔｒ通路抑制Ｔ０ＲＣ１活性从而激活自噬流，并且通过独立于Ｔ０ＲＣ１的机制?
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