过表达microRNA-196a抑制氯化高铁血红素诱导K562细胞的凋亡
发布时间：2021-08-08 23:07
目的利用氯化高铁血红素诱导K562细胞进行红系定向分化的特点,构建细胞模型;借助该模型,探讨mi R-196a对红细胞凋亡的影响及其发生机制。方法K562细胞经氯化高铁血红素诱导后,采用QPCR定量分析细胞γ-globin和CD235a的含量,同时用联苯胺染色实验定性分析细胞诱导后血红蛋白的表达情况。构建mi R-196a模拟物和mi RNA小发卡阴性对照物（mi RNA-Sh NC）的载体,与病毒包装后转染入氯化高铁血红素诱导K562细胞中,建立相应的稳定转导细胞株并验证。随后用CCK-8法检测细胞的增殖率,用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率的变化,并结合Western blotting的方法检测一些与细胞周期和凋亡相关的蛋白的表达。再利用生物信息学方法预测mi R-196a的靶基因,双荧光素酶报告基因实验对该靶基因进行验证,最后过表达该靶基因后分析细胞增殖及凋亡情况。所有数据均采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。结果K562细胞在25μM氯化高铁血红素诱导24 h后,γ-globin、CD235a及联苯胺染色阳性细胞均较对照组增多,即能够成功向红系分化。过表达mi R-196a...
【文章来源】：安徽医科大学安徽省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
利用25μM氯化高铁血红素作用24小时，可诱导K562细胞向早期红系分化
安徽医科大学硕士学位论文343.2过表达miR-196a促进氯化高铁血红素诱导K562细胞的增殖转染miR-196amimics后，miR-196a的相对表达较对照组明显上调（图2A）。CCK-8分析结果显示，miR-196amimics组与对照细胞组（miRNA-ShNC组和空白对照组）相比，显著提高了氯化高铁血红素诱导K562细胞的存活率（图2B）。细胞周期分析显示，与对照组相比，miR-196amimics组处于G0/G1期的细胞占比较少，而在S期和G2/M期则明显偏多。这意味着miR-196amimics组中，从G0/G1期过渡到S期的细胞比对照组多（图2C）。由此可见，miR-196a促进了氯化高铁血红素诱导K562细胞的增殖，并加速了其从G0/G1期向S期的转变。图2.miR-196a过表达对氯化高铁血红素诱导K562细胞的增殖和细胞周期转换的影响。（A）RT-PCR检测miR-196a在miR-196amimics和miRNA-ShNC转染后细胞中的表达。（B）CCK-8法检测细胞增殖。（C）用流式细胞仪分析细胞周期。所有数据以平均值±标准差表示。每次处理一式三份，全部实验重复三次。*p<0.05，**p<0.01。空白对照，系无miRNA转染的阴性对照。miRNA-ShNC，microRNA小发夹阴性对照。
安徽医科大学硕士学位论文353.3miR-196a过表达抑制氯化高铁血红素诱导K562细胞凋亡将miR-196amimics及miRNA-ShNC分别转染氯化高铁血红素诱导K562细胞，再用AnnexinV/PI双染法标记细胞，其凋亡检测结果显示miR-196amimics组细胞凋亡率明显低于对照组(图3A，3B)。此外，还检测了一些凋亡蛋白，如Bax和Bcl-2[21]。蛋白印迹结果显示miR-196a的过度表达下调了Bax的表达，但上调了Bcl-2的表达（图3C）。总之，这些结果提示过表达miR-196a可抑制氯化高铁血红素诱导K562细胞的凋亡。图3.过表达miR-196a对氯化高铁血红素诱导K562细胞凋亡的影响。（A,B）将miR-196amimics及miRNA-ShNC分别转染氯化高铁血红素诱导后的K562细胞中，流式细胞仪检测细胞凋亡率。空白组系无处理组。（C）以β-actin为内参，检测miR-196amimics及miRNA-ShNC分别转染氯化高铁血红素诱导K562细胞的Bax和Bcl-2蛋白水平。所有数据以平均值±标准差表示。每次处理一式三份，全部实验重复三次。*p<0.05。空白对照，系无miRNA转染的阴性对照。miRNA-ShNC，microRNA小发夹阴性对照。
本文编号：3330854
【文章来源】：安徽医科大学安徽省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
利用25μM氯化高铁血红素作用24小时，可诱导K562细胞向早期红系分化
安徽医科大学硕士学位论文343.2过表达miR-196a促进氯化高铁血红素诱导K562细胞的增殖转染miR-196amimics后，miR-196a的相对表达较对照组明显上调（图2A）。CCK-8分析结果显示，miR-196amimics组与对照细胞组（miRNA-ShNC组和空白对照组）相比，显著提高了氯化高铁血红素诱导K562细胞的存活率（图2B）。细胞周期分析显示，与对照组相比，miR-196amimics组处于G0/G1期的细胞占比较少，而在S期和G2/M期则明显偏多。这意味着miR-196amimics组中，从G0/G1期过渡到S期的细胞比对照组多（图2C）。由此可见，miR-196a促进了氯化高铁血红素诱导K562细胞的增殖，并加速了其从G0/G1期向S期的转变。图2.miR-196a过表达对氯化高铁血红素诱导K562细胞的增殖和细胞周期转换的影响。（A）RT-PCR检测miR-196a在miR-196amimics和miRNA-ShNC转染后细胞中的表达。（B）CCK-8法检测细胞增殖。（C）用流式细胞仪分析细胞周期。所有数据以平均值±标准差表示。每次处理一式三份，全部实验重复三次。*p<0.05，**p<0.01。空白对照，系无miRNA转染的阴性对照。miRNA-ShNC，microRNA小发夹阴性对照。
安徽医科大学硕士学位论文353.3miR-196a过表达抑制氯化高铁血红素诱导K562细胞凋亡将miR-196amimics及miRNA-ShNC分别转染氯化高铁血红素诱导K562细胞，再用AnnexinV/PI双染法标记细胞，其凋亡检测结果显示miR-196amimics组细胞凋亡率明显低于对照组(图3A，3B)。此外，还检测了一些凋亡蛋白，如Bax和Bcl-2[21]。蛋白印迹结果显示miR-196a的过度表达下调了Bax的表达，但上调了Bcl-2的表达（图3C）。总之，这些结果提示过表达miR-196a可抑制氯化高铁血红素诱导K562细胞的凋亡。图3.过表达miR-196a对氯化高铁血红素诱导K562细胞凋亡的影响。（A,B）将miR-196amimics及miRNA-ShNC分别转染氯化高铁血红素诱导后的K562细胞中，流式细胞仪检测细胞凋亡率。空白组系无处理组。（C）以β-actin为内参，检测miR-196amimics及miRNA-ShNC分别转染氯化高铁血红素诱导K562细胞的Bax和Bcl-2蛋白水平。所有数据以平均值±标准差表示。每次处理一式三份，全部实验重复三次。*p<0.05。空白对照，系无miRNA转染的阴性对照。miRNA-ShNC，microRNA小发夹阴性对照。
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