温度诱导Targetron系统用于大肠杆菌高效基因失活

发布时间：2021-08-10 05:01

　　构建基于Te I3c/4c嗜热二型内含子的温度诱导Targetron基因失活系统（Thermotargetron）,并应用于中温微生物基因编辑。在大肠杆菌HMS174（DE3）基因组中,选择Subunitofflagellum基因（fliC）和C4dicarboxylate orotate:H+symporter基因（dctA）为靶基因。根据Te I3c/4c DNA识别规则,在fliC和dctA基因中选择fliC489a、fliC828s、fliC1038s和dctA2a位点为基因打靶位点。使用重叠延伸PCR方法,基于pHK-TT1A质粒构建打靶载体。打靶载体转化HMS174菌株,对数期转化子培养液48℃热激1h后涂布于氯霉素抗性LB平板上。使用菌落PCR和DNA测序检测突变株并计算基因失活效率。获得突变株后,通过琼脂穿刺和碳源代谢实验,鉴定ΔfliC、ΔdctA突变株表型变化。菌落PCR测序结果表明,Te I3c/4c插入到fliC和dctA基因设计位点,且打靶效率高达100%。突变株表型验证实验表明,ΔfliC突变株运动能力显著下降,ΔdctA突变株苹果酸代谢能力缺失。综上所述,... 

【文章来源】：生物工程学报. 2020,36(08)北大核心CSCD

【文章页数】：13 页

【部分图文】：

图4 两轮PCR突变TeI3c/4c靶序列识别位点

值得注意的是Thermotargetron核心元件TeI3c/4c二型内含子只在高温时(48–60℃)具有“归巢”活性。因此，Thermotargetron具有2个特征：(1)适用于嗜热微生物基因失活[14];(2)在可耐高温的中温微生物中，具有温度诱导特征。温度诱导属于物理诱导，相比ClosTron系统的化学诱导，具有易实现(无需从头构建诱导表达系统)、更精确(精确控制保温时间)和更直接(直接控制TeI3c/4c活性)等优点。除此之外Thermotargetron系统识别序列为“AAnnnnnnnnnnnnn A”，对于GC含量比较低的中温微生物具有更多的靶点可供选择，即其更适合低GC含量微生物的基因打靶。本研究利用来源于热纤梭菌groEL启动子表达Thermotargetron核心元件TeI3c/4c二型内含子，以HMS174(DE3)为可耐高温的中温微生物模型，并以其fliC和dctA基因为靶基因，验证温度诱导型Thermotargetron基因失活系统的可行性，为中温微生物的基因编辑提供新的工具。1 材料与方法

HMS174 fliC基因(ECHMS174＿01916)和dctA基因(ECHMS174＿03796)全长分别为1 497 bp和1 287 bp(图2A)。在fliC基因中选择位点符合TeI3c/4c识别规律的fliC489a(5′-AA gagttttagcatcA-3′)、fliC828s(5′-AAtactactaaagct A-3′)和fliC1038s(5′-AAaactattacctatA-3′)位点。在dctA基因中选择dctA2a(5′-AAcagagaggttttc A-3′)位点。使用PCR突变野生型TeI3c/4c IBS1、IBS2、EBS1和EBS2位点，构建针对fliC489a、828s、1038s和dctA2a四个识别位点的打靶质粒pHK-TT1A-fliC489a、pHK-TT1A-fliC828s、pHK-TT1A-fliC1038s和pHK-TT1A-dctA2a(图2B)。2.2 Thermotargetron打靶质粒构建

【参考文献】：
期刊论文
[1]大肠杆菌中dctA基因敲除及其苹果酸摄取功能鉴定[J]. 姜巨全,张正来,徐桐,孟琳.  东北农业大学学报. 2018(05)
[2]大肠杆菌FliC基因敲除后对大肠杆菌生物膜形成的影响[J]. 喻华英,马燕.  中国兽医学报. 2016(08)



本文编号：3333513