人同型融合和蛋白质分选复合体亚基的原核表达、蛋白纯化及功能验证

发布时间：2021-08-12 11:46

　　同型融合和蛋白质分选复合体（HOPS）由VPS11、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41这6种蛋白组成,能够通过膜融合机制来调节生物体内的膜泡运输。已有研究表明其可以作为融合因子来促进自噬体与溶酶体膜融合过程。为在体外确定HOPS复合体与自噬性SNARE蛋白STX17是否具有直接相互作用,首先利用PCR技术从已有质粒中扩增得到6种基因的编码序列,将其连接至pGEX 4T-1-GST或pET-His-NusA原核表达载体上,经菌落PCR初步鉴定和DNA测序无误后成功构建6种原核表达重组质粒并转化至大肠杆菌BL21（DE3）;利用谷胱甘肽琼脂糖树脂与镍柱对重组蛋白进行纯化,烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶酶切掉GST或His-NusA标签,得到分子量约为105 kDa的HA-VPS11蛋白、97 kDa的Flag-VPS16蛋白、108 kDa的HA-VPS18蛋白、70 kDa的Flag-VPS33蛋白、97 k Da的HA-VPS39蛋白和98 kDa的Flag-VPS41蛋白;通过体外GST pull-down技术对6种蛋白的功能进行验证,证实自噬性SNARE蛋白S... 

【文章来源】：生物工程学报. 2020,36(01)北大核心CSCD

【文章页数】：10 页

【部分图文】：

VPS18、VPS39和VPS11基因的PCR扩增

VPS16、VPS41和VPS33基因的PCR扩增

经SDS-PAGE和Western blotting方法检测得出以下结果：利用镍柱亲和层析方式成功纯化得到分子量在105 kDa左右的HA-VPS11重组蛋白、108 kDa左右的HA-VPS18重组蛋白及97 kDa左右的HA-VPS39重组蛋白(图7)；利用谷胱甘肽亲和层析方式成功纯化得到分子量在97 kDa左右的Flag-VPS16重组蛋白、70 kDa左右的Flag-VPS33重组蛋白及98 kDa左右的Flag-VPS41重组蛋白(图8)。图4 pGEX 4T-1-GST载体图谱

【参考文献】：
期刊论文
[1]猪伪狂犬病毒引起PK-15细胞自噬的研究[J]. 许长萌,王志建,王咪,刘倩玉,王先炜.  南京农业大学学报. 2018(04)
[2]人ATG4B的表达及蛋白纯化和鉴定[J]. 黄蓉,徐小洁,梁迎春,张立,王涛,周丽英,杜楠,叶棋浓.  细胞与分子免疫学杂志. 2015(02)
[3]HOPS复合体蛋白在细胞自噬过程中的功能研究[J]. 胡晚秋,林志祥,陈丽莲,晏向华,陈放.  中国细胞生物学学报. 2011(08)



本文编号：3338267