重组嗜酸乳杆菌表达Oxa氧化酶及其特性研究
发布时间：2021-08-12 12:58
玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是镰刀菌属产生的类雌激素毒素,可对人体及家禽造成生殖毒性、遗传毒性、免疫毒性等多种毒性,在农作物的生长、收获、加工、运输及储存过程中都可能受其污染,可在全世界范围内对人体健康造成威胁。针对此现状,本研究从生物脱毒法着手对ZEN的脱毒降解进行研究,现有资料表明,嗜酸乳杆菌是乳酸菌中被广泛研究的益生菌之一,其在肠道中较强的黏附能力和较高的耐酸耐胆盐能力,具有调节胃肠道菌群环境、提高机体免疫力、抑制致病菌等多重益生特性,在乳品、饮料、饲料等食品领域中均得到了开发应用,在医学研究应用中也有所贡献,基于此,本实验选定嗜酸乳杆菌通过基因克隆手段使其获得生物法降解ZEN的能力。本论文以实验室已有的质粒p PIC9K-Oxa为模板,设计引物P1、P2,扩增从不动杆菌SM04分离的ZEN降解酶Oxa基因插入乳杆菌穿梭载体p MG36e中,化学法转入E.coli JM109构建重组质粒p MG36e-Oxa,再将重组质粒克隆到嗜酸乳杆菌ATCC4356中,通过重组菌的培养表达获得重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和ZEN降解实验对重组蛋白Oxa的表达和降解活性进...
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
目的基因PCR扩增产物电泳图
第二章重组质粒pMG36e-Oxa构建17按2.2.4中的扩增条件进行菌落PCR扩增，取5μL扩增产物通过1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。将电泳结果中成功扩增出目的基因条带的阳性转化子分别接种到50mL含抗生素抗性的LB液体培养基中，37°C恒温180r/min摇床过夜培养，并将培养物按照本章2.2.2的方法提取质粒后进行双酶切，使用1%琼脂糖凝胶电泳观察结果进行初步鉴定，同时将阳性重组子菌体培养液送至生物工程（上海）有限公司提取质粒进行测序，测序引物如表2-3所示：表2-3引物Table.2-3Primers名称序列长度F15’-GGATTTTTGTGAGCTTGGAC-3’20bpF25’-ACCATTTGACTTTGAACCTC-3’20bp2.4实验结果与讨论2.4.1目的基因扩增及载体提取Oxa基因片段经PCR扩增后经1%琼脂糖凝胶电泳检测，显示所得产物条带片段约为820bp，与引物设计扩增后所得产物长度（820bp）相符（如图2-1所示）。将从E.coliDH5α中提取的质粒pMG36e使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，成功提取到所需载体（如图2-2所示）。M11M22M1.2000DNAMarkerM2.5000DNAMarker1.PCR扩增产物2.质粒pMG36e条带图2-1目的基因PCR扩增产物电泳图图2-2提取质粒pMG36e条带Fig.2-1ElectrophoresisanalysisFig.2-2Electrophoresisanalysis2.4.2重组质粒构建及鉴定将双酶切后回收的载体片段VectorDNA（如图2-3所示）与目的基因片段InsertDNA进行连接，构建重组质粒pMG36e-Oxa，通过化学法转化至大肠杆菌2000100075050050003000目的基因pMG36e
华南理工大学工程硕士学位论文18后通过菌落PCR进行重组子挑选，菌落PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2-4所示，从含抗生素的LB平板上所选的两个单菌落均成功扩增出了与目的基因（820bp）片段大小一致的条带。将PCR扩增成功的转化子单菌落接种至含有抗生素抗性标记的LB液体培养基中富集培养后提取质粒进行双酶切鉴定，酶切产物电泳结果如图2-5所示，双酶切产物中含有与载体片段（3.6kb）大小相一致的条带和与目的基因（820bp）片段大小相一致的条带，初步证明重组质粒pMG36e-Oxa成功构建并导入至E.coliJM109中。M31234M3.23130DNAMaker1.质粒pMG36e2.质粒pMG36eSmaI单酶切3.质粒pMG36eHindШ单酶切4.质粒pMG36eSmaI、HindШ双酶切条带图2-3质粒pMG36e双酶切电泳结果Fig.2-3ElectrophoresisanalysisM212M23M2.5000DNAMarker1,2.PCR扩增产物条带3.重组质粒双酶切条带图2-4菌落PCR电泳图图2-5重组质粒双酶切电泳图Fig.2-4ElectrophoresisanalysisFig.2-5Electrophoresisanalysis同时，经生物工程（上海）有限公司的质粒测序鉴定结果（如图2-6所示），从102bp开始至887bp结束，为目的基因Oxa的基因序列，而102bp以前的序列及887bp以后的序列分别为两个酶切位点序列及相对应的载体连接序列，根43612322202750003000750pMG36e目的基因目的基因双酶切片段
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组ZEN降解酶Oxa的纯化及特性研究[J]. 朋贤,杨继国,朱洁盈,郭景景,唐语谦. 现代食品科技. 2019(05)
[2]玉米赤霉烯酮降解酶基因zhd101表达载体构建及在大肠杆菌中表达[J]. 龙淼,刘义,陈新亮,何润霞,张燚,何剑斌,高增贵. 畜牧与兽医. 2016(01)
[3]玉米赤霉烯酮对猪的毒性作用及其生物降解研究进展[J]. 陈继发,张佳鑫,曲湘勇,彭豫东. 中国饲料. 2015(19)
[4]可降解玉米赤霉烯酮的重组过氧化物酶A4-Prx的纯化与活性研究[J]. 钟凤,吴晖,刘思利,唐语谦. 现代食品科技. 2015(08)
[5]饲料中玉米赤霉烯酮脱毒技术研究[J]. 李溪,王金荣,赵银丽,苏兰利,朱雪飞,陈培英. 饲料研究. 2015(13)
[6]表达鼠源GLP-2重组嗜酸乳杆菌的构建[J]. 白云,韩博,栗楠,严轩,谢姗姗,刘殿峰,姜云垒. 中国兽医学报. 2015(05)
[7]表达EPEC紧密素蛋白重组嗜酸乳酸杆菌的免疫效果检测[J]. 郝凤奇,李景梅,杨洲红. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2015(06)
[8]鸡源性嗜酸乳杆菌对肉鸡小肠黏膜免疫相关细胞的影响[J]. 祁凤华,扇玉斌,周立强,徐春生,张文举. 石河子大学学报(自然科学版). 2015(01)
[9]嗜酸乳杆菌对黄羽肉鸡生长性能及营养物质代谢率的影响[J]. 祁凤华,周立强,马红,徐春生. 畜牧与兽医. 2014(04)
[10]饲料和原料中玉米赤霉烯酮的危害及检测方法探讨[J]. 侯月娥,姜瑞丽,李旭宁,田书会. 当代畜牧. 2014(03)
博士论文
[1]猪流行性腹泻病毒S基因变异分析及嗜酸乳杆菌口服疫苗的研究[D]. 张月.山东农业大学 2016
硕士论文
[1]Pichia Pastoris分泌表达A4-Oxa酶及降解玉米赤霉烯酮的研究[D]. 刘思利.华南理工大学 2017
[2]饲用抑菌活性乳酸菌共培养筛选、优化及抗性分析[D]. 徐秀伟.安徽农业大学 2016
[3]高效表达抗菌肽PNK-19的嗜酸乳杆菌表达体系的建立[D]. 赵志雨.河南科技学院 2014
[4]动物肠道中嗜酸乳杆菌粘附作用研究[D]. 李振梅.山东师范大学 2007
本文编号：3338360
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
目的基因PCR扩增产物电泳图
第二章重组质粒pMG36e-Oxa构建17按2.2.4中的扩增条件进行菌落PCR扩增，取5μL扩增产物通过1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。将电泳结果中成功扩增出目的基因条带的阳性转化子分别接种到50mL含抗生素抗性的LB液体培养基中，37°C恒温180r/min摇床过夜培养，并将培养物按照本章2.2.2的方法提取质粒后进行双酶切，使用1%琼脂糖凝胶电泳观察结果进行初步鉴定，同时将阳性重组子菌体培养液送至生物工程（上海）有限公司提取质粒进行测序，测序引物如表2-3所示：表2-3引物Table.2-3Primers名称序列长度F15’-GGATTTTTGTGAGCTTGGAC-3’20bpF25’-ACCATTTGACTTTGAACCTC-3’20bp2.4实验结果与讨论2.4.1目的基因扩增及载体提取Oxa基因片段经PCR扩增后经1%琼脂糖凝胶电泳检测，显示所得产物条带片段约为820bp，与引物设计扩增后所得产物长度（820bp）相符（如图2-1所示）。将从E.coliDH5α中提取的质粒pMG36e使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，成功提取到所需载体（如图2-2所示）。M11M22M1.2000DNAMarkerM2.5000DNAMarker1.PCR扩增产物2.质粒pMG36e条带图2-1目的基因PCR扩增产物电泳图图2-2提取质粒pMG36e条带Fig.2-1ElectrophoresisanalysisFig.2-2Electrophoresisanalysis2.4.2重组质粒构建及鉴定将双酶切后回收的载体片段VectorDNA（如图2-3所示）与目的基因片段InsertDNA进行连接，构建重组质粒pMG36e-Oxa，通过化学法转化至大肠杆菌2000100075050050003000目的基因pMG36e
华南理工大学工程硕士学位论文18后通过菌落PCR进行重组子挑选，菌落PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2-4所示，从含抗生素的LB平板上所选的两个单菌落均成功扩增出了与目的基因（820bp）片段大小一致的条带。将PCR扩增成功的转化子单菌落接种至含有抗生素抗性标记的LB液体培养基中富集培养后提取质粒进行双酶切鉴定，酶切产物电泳结果如图2-5所示，双酶切产物中含有与载体片段（3.6kb）大小相一致的条带和与目的基因（820bp）片段大小相一致的条带，初步证明重组质粒pMG36e-Oxa成功构建并导入至E.coliJM109中。M31234M3.23130DNAMaker1.质粒pMG36e2.质粒pMG36eSmaI单酶切3.质粒pMG36eHindШ单酶切4.质粒pMG36eSmaI、HindШ双酶切条带图2-3质粒pMG36e双酶切电泳结果Fig.2-3ElectrophoresisanalysisM212M23M2.5000DNAMarker1,2.PCR扩增产物条带3.重组质粒双酶切条带图2-4菌落PCR电泳图图2-5重组质粒双酶切电泳图Fig.2-4ElectrophoresisanalysisFig.2-5Electrophoresisanalysis同时，经生物工程（上海）有限公司的质粒测序鉴定结果（如图2-6所示），从102bp开始至887bp结束，为目的基因Oxa的基因序列，而102bp以前的序列及887bp以后的序列分别为两个酶切位点序列及相对应的载体连接序列，根43612322202750003000750pMG36e目的基因目的基因双酶切片段
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组ZEN降解酶Oxa的纯化及特性研究[J]. 朋贤,杨继国,朱洁盈,郭景景,唐语谦. 现代食品科技. 2019(05)
[2]玉米赤霉烯酮降解酶基因zhd101表达载体构建及在大肠杆菌中表达[J]. 龙淼,刘义,陈新亮,何润霞,张燚,何剑斌,高增贵. 畜牧与兽医. 2016(01)
[3]玉米赤霉烯酮对猪的毒性作用及其生物降解研究进展[J]. 陈继发,张佳鑫,曲湘勇,彭豫东. 中国饲料. 2015(19)
[4]可降解玉米赤霉烯酮的重组过氧化物酶A4-Prx的纯化与活性研究[J]. 钟凤,吴晖,刘思利,唐语谦. 现代食品科技. 2015(08)
[5]饲料中玉米赤霉烯酮脱毒技术研究[J]. 李溪,王金荣,赵银丽,苏兰利,朱雪飞,陈培英. 饲料研究. 2015(13)
[6]表达鼠源GLP-2重组嗜酸乳杆菌的构建[J]. 白云,韩博,栗楠,严轩,谢姗姗,刘殿峰,姜云垒. 中国兽医学报. 2015(05)
[7]表达EPEC紧密素蛋白重组嗜酸乳酸杆菌的免疫效果检测[J]. 郝凤奇,李景梅,杨洲红. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2015(06)
[8]鸡源性嗜酸乳杆菌对肉鸡小肠黏膜免疫相关细胞的影响[J]. 祁凤华,扇玉斌,周立强,徐春生,张文举. 石河子大学学报(自然科学版). 2015(01)
[9]嗜酸乳杆菌对黄羽肉鸡生长性能及营养物质代谢率的影响[J]. 祁凤华,周立强,马红,徐春生. 畜牧与兽医. 2014(04)
[10]饲料和原料中玉米赤霉烯酮的危害及检测方法探讨[J]. 侯月娥,姜瑞丽,李旭宁,田书会. 当代畜牧. 2014(03)
博士论文
[1]猪流行性腹泻病毒S基因变异分析及嗜酸乳杆菌口服疫苗的研究[D]. 张月.山东农业大学 2016
硕士论文
[1]Pichia Pastoris分泌表达A4-Oxa酶及降解玉米赤霉烯酮的研究[D]. 刘思利.华南理工大学 2017
[2]饲用抑菌活性乳酸菌共培养筛选、优化及抗性分析[D]. 徐秀伟.安徽农业大学 2016
[3]高效表达抗菌肽PNK-19的嗜酸乳杆菌表达体系的建立[D]. 赵志雨.河南科技学院 2014
[4]动物肠道中嗜酸乳杆菌粘附作用研究[D]. 李振梅.山东师范大学 2007
本文编号：3338360
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3338360.html
