枯草芽孢杆菌底盘细胞的设计、构建与应用
发布时间：2021-08-14 18:26
作为一种重要的模式工业微生物和食品安全微生物,枯草芽孢杆菌在工业酶和功能营养品的生产方面具有广泛应用。近年来,随着对枯草芽孢杆菌遗传调控机制的不断揭示,多种研究策略和技术,包括基因编辑系统、基因回路、空间支架、无细胞表达系统等,被用于设计和构建枯草芽孢杆菌底盘细胞高效合成各种生物化学品。本文首先对基于基因编辑和基于内源性调控系统的枯草芽孢杆菌底盘细胞设计与构建的策略进行了系统的概述。然后,以高产N-乙酰氨基葡萄糖、七烯甲萘醌、核黄素、透明质酸和β-环糊精糖基转移酶为例介绍了枯草芽孢杆菌底盘细胞工厂的应用。最后,从基因编辑效率提升、基因回路响应信号拓展和基因组设计与重构三方面对枯草芽孢杆菌底盘细胞的设计、构建与应用进行了展望。
【文章来源】：合成生物学. 2020,1(02)
【文章页数】：19 页
【部分图文】：
CRISPRa/CRISPRi系统转录激活和抑制的示意图
无细胞蛋白表达系统（cell-free protein synthesis,CFPS），是一种相对胞内表达系统而言的开放表达系统。它是以外源m RNA或DNA为模板，利用原核或真核细胞抽提物的酶系，添加氨基酸、RNA聚合酶和能量物质等来表达蛋白质的体外翻译系统[69]（图2）。利用无细胞蛋白表达系统，可以提高蛋白合成的效率，还可以通过掺入非天然氨基酸，在体外表达非天然蛋白质[70]。尽管无细胞系统通过制备方法的优化得到了一些改进[71]，但这些研究大部分集中在E.coli无细胞系统的改进上，而针对B.subtilis无细胞系统的报道较少。作为一种重要的GRAS模式生物，B.subtilis无细胞系统的开发可能更适用于广泛的微生物学、合成生物学和工业生物技术应用。比如，B.subtilis调控元件的无细胞系统在与体内研究结合时可发挥协同优势，经过多轮无细胞表征的工作流程可导致设计周期的快速迭代，从而有助于在体内进行最终的设计[72]。由于B.subtilis 168表达的异源蛋白质容易被其自身分泌的内源性蛋白酶降解，因此利用B.subtilis 168无细胞系统表达异源蛋白的能力有限，只能产生低产量的报告蛋白GFP（小于0.3μg/m L）。因此，研究人员选择蛋白酶缺陷菌株B.subtilis WB800N作为出发菌株[73]，通过工程化启动子文库表征的遗传调控元件来优化B.subtilis WB800N无细胞系统，对58种不同类型启动子构建的无细胞GFPmut3b体系进行初步筛选，在体外利用B.subtilis WB800N细胞提取物一起表达GFPmut3b，通过GFPmut3b的表征确定了几种不同强度启动子的B.subtilis WB800N无细胞体系[15]。改良的B.subtilis WB800N无细胞系统能够进行持续数小时的无细胞转录翻译反应，并产生多达0.8μmol/L GFPmut3b，是B.subtilis 168无细胞转录翻译系统（0.011μmol/L GFPmut3b）的72倍。最后将B.subtilis WB800N无细胞系统应用在诱导型表达系统中，以肾素荧光素酶为报告蛋白，证明了B.subtilis WB800N无细胞转录翻译系统对异源蛋白的生产和表征具有潜在的适用性。除启动子的转录强弱外，影响B.subtilis WB800N无细胞系统表达异源蛋白的效率可能还包括其他因素，例如，在无细胞系统表达蛋白质过程中，产生的乳酸、乙酸或无机磷酸盐会导致体系的p H值发生变化，这也可能对无细胞体系有害。而这些限制因素可以通过使用其他能源得以缓解，比如，麦芽糖是一种能在E.coli无细胞表达系统中消耗抑制性无机磷酸盐的碳源物质[74]。通过这些潜在抑制因素的研究可以进一步提高B.subtilis无细胞表达系统的效率，从而快速、大量生产具有高营养价值的功能性蛋白。
在B.subtilis中，感受态的形成受到两种感受态因子（Com X和CFS）的调节，当细胞达到一定的数目，感受态因子的浓度积累到一定临界值时诱导感受态的形成[80]。由com Q编码的Com Q蛋白经修饰处理后，产生具有活性的信号分子Com X并分泌到胞外，使信号感应蛋白Com P发生自磷酸化，随后该酶将相应的应答调节蛋白Com A磷酸化，磷酸化的Com A和srf操纵子结合，激活该操纵子的转录产生Com S蛋白，Com S与Clp C、Com K、Mec A蛋白一起参与接下来的信号传导，细胞进入感受态状态。CSF发挥作用的方式与Com Q有一些不同，由phr编码的CSF前体在跨膜转运后形成成熟的CSF，当胞外的CSF浓度达到一定浓度时，通过Spo0K转运至胞内，通过抑制Rap C的活性从而促进Com A的磷酸化，促进感受态的形成[81]。基于上述原理，Guan等[21]利用参与信号传导的srf操纵子的启动子Psrf A，构建了一种不需要添加诱导剂的细胞密度依赖型B.subtilis表达系统，可以实现菌体的高密度生长及异源蛋白氨肽酶和纳豆激酶的高效表达。而芽孢的形成主要受到组氨酸激酶Kin A-E和转录因子Spo0A的调节：Spo0A受到群体响应信号分子Phr-Rap的调节，经过组氨酸激酶Kin A-E和两个磷酸转移蛋白Spo0F和Spo0B的作用，Spo0A被磷酸化，调控相关靶基因的表达，进而促进芽孢的形成。Rap60不仅可抑制Spo0A磷酸化水平，也可以抑制Kin A的活性，而Rap60则可以被响应细胞密度的信号分子Phr60所抑制[82]。基于该原理，Cui等[22]在B.subtilis中开发了一种Phr60-Rap60-Spo0A双功能群体响应调控系统，细胞浓度增加可同时激活和抑制多个基因模块系统的表达，并将该系统动态控制B.subtilis 168中七烯甲萘醌的合成途径，验证了该系统的有效性。2.3 Ⅰ型毒素/抗毒素调控系统
【参考文献】：
期刊论文
[1]枯草芽孢杆菌ccpA基因敲除及对其核黄素产量的影响[J]. 应明,班睿. 微生物学报. 2006(01)
博士论文
[1]基因组简化枯草芽孢杆菌的构建及应用[D]. 李杨.天津大学 2017
本文编号：3342966
【文章来源】：合成生物学. 2020,1(02)
【文章页数】：19 页
【部分图文】：
CRISPRa/CRISPRi系统转录激活和抑制的示意图
无细胞蛋白表达系统（cell-free protein synthesis,CFPS），是一种相对胞内表达系统而言的开放表达系统。它是以外源m RNA或DNA为模板，利用原核或真核细胞抽提物的酶系，添加氨基酸、RNA聚合酶和能量物质等来表达蛋白质的体外翻译系统[69]（图2）。利用无细胞蛋白表达系统，可以提高蛋白合成的效率，还可以通过掺入非天然氨基酸，在体外表达非天然蛋白质[70]。尽管无细胞系统通过制备方法的优化得到了一些改进[71]，但这些研究大部分集中在E.coli无细胞系统的改进上，而针对B.subtilis无细胞系统的报道较少。作为一种重要的GRAS模式生物，B.subtilis无细胞系统的开发可能更适用于广泛的微生物学、合成生物学和工业生物技术应用。比如，B.subtilis调控元件的无细胞系统在与体内研究结合时可发挥协同优势，经过多轮无细胞表征的工作流程可导致设计周期的快速迭代，从而有助于在体内进行最终的设计[72]。由于B.subtilis 168表达的异源蛋白质容易被其自身分泌的内源性蛋白酶降解，因此利用B.subtilis 168无细胞系统表达异源蛋白的能力有限，只能产生低产量的报告蛋白GFP（小于0.3μg/m L）。因此，研究人员选择蛋白酶缺陷菌株B.subtilis WB800N作为出发菌株[73]，通过工程化启动子文库表征的遗传调控元件来优化B.subtilis WB800N无细胞系统，对58种不同类型启动子构建的无细胞GFPmut3b体系进行初步筛选，在体外利用B.subtilis WB800N细胞提取物一起表达GFPmut3b，通过GFPmut3b的表征确定了几种不同强度启动子的B.subtilis WB800N无细胞体系[15]。改良的B.subtilis WB800N无细胞系统能够进行持续数小时的无细胞转录翻译反应，并产生多达0.8μmol/L GFPmut3b，是B.subtilis 168无细胞转录翻译系统（0.011μmol/L GFPmut3b）的72倍。最后将B.subtilis WB800N无细胞系统应用在诱导型表达系统中，以肾素荧光素酶为报告蛋白，证明了B.subtilis WB800N无细胞转录翻译系统对异源蛋白的生产和表征具有潜在的适用性。除启动子的转录强弱外，影响B.subtilis WB800N无细胞系统表达异源蛋白的效率可能还包括其他因素，例如，在无细胞系统表达蛋白质过程中，产生的乳酸、乙酸或无机磷酸盐会导致体系的p H值发生变化，这也可能对无细胞体系有害。而这些限制因素可以通过使用其他能源得以缓解，比如，麦芽糖是一种能在E.coli无细胞表达系统中消耗抑制性无机磷酸盐的碳源物质[74]。通过这些潜在抑制因素的研究可以进一步提高B.subtilis无细胞表达系统的效率，从而快速、大量生产具有高营养价值的功能性蛋白。
在B.subtilis中，感受态的形成受到两种感受态因子（Com X和CFS）的调节，当细胞达到一定的数目，感受态因子的浓度积累到一定临界值时诱导感受态的形成[80]。由com Q编码的Com Q蛋白经修饰处理后，产生具有活性的信号分子Com X并分泌到胞外，使信号感应蛋白Com P发生自磷酸化，随后该酶将相应的应答调节蛋白Com A磷酸化，磷酸化的Com A和srf操纵子结合，激活该操纵子的转录产生Com S蛋白，Com S与Clp C、Com K、Mec A蛋白一起参与接下来的信号传导，细胞进入感受态状态。CSF发挥作用的方式与Com Q有一些不同，由phr编码的CSF前体在跨膜转运后形成成熟的CSF，当胞外的CSF浓度达到一定浓度时，通过Spo0K转运至胞内，通过抑制Rap C的活性从而促进Com A的磷酸化，促进感受态的形成[81]。基于上述原理，Guan等[21]利用参与信号传导的srf操纵子的启动子Psrf A，构建了一种不需要添加诱导剂的细胞密度依赖型B.subtilis表达系统，可以实现菌体的高密度生长及异源蛋白氨肽酶和纳豆激酶的高效表达。而芽孢的形成主要受到组氨酸激酶Kin A-E和转录因子Spo0A的调节：Spo0A受到群体响应信号分子Phr-Rap的调节，经过组氨酸激酶Kin A-E和两个磷酸转移蛋白Spo0F和Spo0B的作用，Spo0A被磷酸化，调控相关靶基因的表达，进而促进芽孢的形成。Rap60不仅可抑制Spo0A磷酸化水平，也可以抑制Kin A的活性，而Rap60则可以被响应细胞密度的信号分子Phr60所抑制[82]。基于该原理，Cui等[22]在B.subtilis中开发了一种Phr60-Rap60-Spo0A双功能群体响应调控系统，细胞浓度增加可同时激活和抑制多个基因模块系统的表达，并将该系统动态控制B.subtilis 168中七烯甲萘醌的合成途径，验证了该系统的有效性。2.3 Ⅰ型毒素/抗毒素调控系统
【参考文献】：
期刊论文
[1]枯草芽孢杆菌ccpA基因敲除及对其核黄素产量的影响[J]. 应明,班睿. 微生物学报. 2006(01)
博士论文
[1]基因组简化枯草芽孢杆菌的构建及应用[D]. 李杨.天津大学 2017
本文编号：3342966
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3342966.html
