牛源大肠埃希菌HPI毒力岛irp1基因敲除及对其毒力和生物学特性影响
发布时间：2021-08-29 04:24
奶牛子宫内膜炎是目前世界各国奶牛养殖和生产中最为常见且造成损失最大的疾病之一,在我国65%至80%奶牛不孕是子宫内膜炎所导致的。引起奶牛子宫内膜炎的主要病原微生物包括细菌、支原体、钩端螺旋体、病毒、真菌及毛滴虫等,细菌中主要是大肠埃希菌、变形杆菌、链球菌和金黄色葡萄球菌等。为了确定大肠埃希菌致病能力与HPI毒力岛irp1基因的关系,本试验使用自杀性质粒p RE112构建了大肠埃希菌irp1基因缺失株和回补株,进行了irp1基因的功能验证,获得如下结果:1. 对14株大肠埃希菌（编号E1-E14）进行氯霉素抗性和irp1基因的检测,菌株E1、E4、E6、E8、E9和E12对氯霉素敏感且irp1基因阳性,选取菌株E4进行irp1基因敲除和回补。2. 使用重叠PCR法,以E4基因组为模板,融合irp1上下游同源臂,克隆融合片段到自杀性质粒p RE112,成功构建重组自杀性质粒p REΔirp1。以含重组自杀性质粒p REΔirp1的大肠埃希菌X7213为供体菌,大肠埃希菌E4为受体菌进行共培养,通过两步同源重组筛选出缺失株E4Δirp1。最后同样使用自杀性质粒p RE112得到回补株E4Δi...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
FeDye3-y复合物结构式（李叶芳,2012）
第二章大肠埃希菌缺失株E4Δirp1和回补株E4Δirp1-C的构建和鉴定9图2-1pRE112限制性图谱（彭颖,2015）Figure2-1RestrictionmapofpRE112（pengying2015）本试验所用菌株和质粒如下表（表2-1）。表2-1本试验所用菌株及质粒列表Table2-1Strainsandplasmidsusedinthisexperiment菌株或质粒Strainsorplasmids种类和基因型TypesandGenotypes来源Source菌株StrainsE4Amps，Cms实验室分离Δirp1E4，irp1基因缺失本人构建Δirp1-CΔirp1，irp1基因缺失后回补本人构建X7213自杀性质粒pRE112宿主菌，DAP-实验室保存质粒PlasmidspRE112pGP704自杀性质粒，pir依赖，包含oriT，oriV，sacB，Cmr实验室保存pREΔirp1pRE112自杀性质粒和irp1上下游序列，包含Cmr本人构建pEASY-T1克隆载体，包含Ampr，Kanr实验室保存pREΔirp1-CpRE112自杀性质粒，irp1及其上下游序列，包含Cmr本人构建2.1.2主要试剂及仪器主要试剂及仪器，分别见表2-2和2-3。表2-2主要试剂Table2-2Mainreagents主要试剂Mainreagents生产厂家ManufacturerPrimerSTARMaxPremix（2X）宝日医生物技术（北京）有限公司Taq酶、T4连接酶、内切酶宝日医生物技术（北京）有限公司氯霉素、氨苄西林粉末快速感受态细胞制备试剂盒（一步法）上海生工生物工程公司上海生工生物工程公司一站式DNA/RNA小量提取试剂盒上海生工生物工程公司UNIQ-10柱式微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒上海生工生物工程公司pEASY-T1CloningVector北京全式金公司
第二章大肠埃希菌缺失株E4Δirp1和回补株E4Δirp1-C的构建和鉴定13物送去生物公司测序，将测序结果正确的质粒命名为pREΔirp1。（4）缺失株Δirp1的筛选无痕缺失突变株筛选原理，如图2-2，具体操作如下：A.含质粒pREΔirp1的X7213与亲本株E4共培养（单交换）取供体菌X7213100μL（含pREΔirp1）和受体菌大肠埃希菌E450μL，置于含500μL无菌LB液体的试管中（含DAP），37℃恒温摇床过夜摇菌，涂布于含有50μg/mL氯霉素的LB固体平板上，37℃恒温培养箱过夜培养，次日挑取单菌落PCR进行鉴定。B.基因缺失株的筛选和鉴定（双交换）PCR条带大小和测序结果正确的即为阳性接合子，于无盐LB液体（含10%蔗糖）中连续传代3-5代，取最后一代菌液稀释涂板，37℃恒温培养箱过夜培养，次日挑取单菌落进行PCR和测序鉴定，PCR条带大小和测序结果都正确的菌株即为突变株，命名为E4Δirp1。图2-2缺失株E4Δirp1构建原理示意图Figure2-2TheschematicdiagramofconstructingE4Δirp1deletionstrain2.2.6回补株E4Δirp1-C的构建为了确定后续试验得到的结果差异是由irp1基因的缺失所致，本试验使用自杀性质粒介导同源重组的方法构建了缺失株E4Δirp1的回补株E4Δirp1-C。使用irp1-A-F和irp1-B-R作为上下游引物、E4基因组为模板进行扩增，可以得到约1953bp的片段，其中包括irp1基因及其上下游同源臂，将自杀性质粒与所得片段连接转化后，最后用两步同源重组的方法即可得到回补株E4Δirp1-C，具体操作步骤详见2.2.5（周秀娟2015）。2.3结果2.3.1基因敲除菌株的筛选14株大肠埃希菌（E1-E14）经过氯霉素检测和irp1基因的PCR筛选，菌株E1、
【参考文献】：
期刊论文
[1]大肠杆菌的研究综述[J]. 殷泽禄,万虎. 甘肃畜牧兽医. 2019(05)
[2]奶牛子宫内膜炎研究进展[J]. 罗光建,王萍,李莹杰,刘英. 今日畜牧兽医. 2019(02)
[3]PEC HPI irp2基因缺失株的构建及蛋白结构功能预测[J]. 刘超英,吴程华,高洪,严玉霖,富国文,赵汝. 中国兽药杂志. 2018(02)
[4]大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2毒力岛研究进展[J]. 尹磊,祁克宗,宋祥军,涂健. 微生物学通报. 2017(12)
[5]猪肠外致病性大肠杆菌对氟喹诺酮类耐药机制研究[J]. 王斌,袁定胜,李金良,李思聪,杨锐,张敏,李旭廷. 黑龙江畜牧兽医. 2017(07)
[6]奶牛子宫内膜炎病因学研究进展[J]. 那立冬,王东升,董书伟,张世栋,闫宝琪,杨洪早,桑梦琪,严作廷. 动物医学进展. 2016(09)
[7]大肠埃希菌强毒力岛核心基因fyuA研究进展[J]. 王庄,张泽辉,刘耀川,张德显,刘明春. 动物医学进展. 2016(08)
[8]副溶血弧菌calR的基因敲除株与回补株构建[J]. 侯书宁,孟彦言,朱文君,张凌宇,周冬生,张义全,黄新祥. 军事医学. 2016(05)
[9]奶牛子宫内膜炎诊疗研究进展[J]. 彭津津,雍康,张传师. 黑龙江畜牧兽医. 2016(02)
[10]肠毒性大肠杆菌gspD基因敲除以及对LT毒素分泌的影响[J]. 鲁曦,傅恩清,潘蕾,穆德广,李王平,金发光. 基因组学与应用生物学. 2015(12)
博士论文
[1]我国北方地区犊牛腹泻大肠杆菌HPI分子结构组成及其菌蜕的研究[D]. 孙武文.吉林农业大学 2016
[2]沙门氏菌C1血清组特异基因功能分析[D]. 周秀娟.上海交通大学 2015
硕士论文
[1]克氏柠檬酸杆菌的生物学特性及其鞭毛素基因fliC的功能[D]. 王乐.西北农林科技大学 2019
[2]大肠埃希菌生物被膜对抗生素和消毒剂药效的影响[D]. 范玉堂.西北农林科技大学 2019
[3]香樟精油对奶牛子宫内膜炎大肠杆菌生物膜的抑制作用研究[D]. 付敬敬.河南农业大学 2018
[4]K88ac+产肠毒素大肠杆菌强毒力岛HPI缺失株的构建及相关毒力功能探析[D]. 许绵.扬州大学 2017
[5]鸡肉中大肠杆菌生物膜的污染情况及石榴皮单宁对大肠杆菌生物膜的干预作用[D]. 杨沁南.西北农林科技大学 2016
[6]K88ac+大肠杆菌减毒株的构建及其在小鼠体内的初步应用[D]. 余树培.扬州大学 2016
[7]K88ac+产肠毒素大肠杆菌sRNA伴侣蛋白Hfq毒力相关功能的研究[D]. 胡会杰.扬州大学 2016
[8]猪源肠外致病性大肠杆菌六型分泌系统hcp基因缺失株的构建及功能研究[D]. 彭颖.华中农业大学 2015
[9]大肠杆菌毒力岛HPI相关基因缺失株的研究[D]. 王晨娟.扬州大学 2012
[10]大肠杆菌O157：H7 O岛缺失规律及O45岛基因缺失对STX2表达的影响[D]. 李贝贝.山西医科大学 2007
本文编号：3369903
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
FeDye3-y复合物结构式（李叶芳,2012）
第二章大肠埃希菌缺失株E4Δirp1和回补株E4Δirp1-C的构建和鉴定9图2-1pRE112限制性图谱（彭颖,2015）Figure2-1RestrictionmapofpRE112（pengying2015）本试验所用菌株和质粒如下表（表2-1）。表2-1本试验所用菌株及质粒列表Table2-1Strainsandplasmidsusedinthisexperiment菌株或质粒Strainsorplasmids种类和基因型TypesandGenotypes来源Source菌株StrainsE4Amps，Cms实验室分离Δirp1E4，irp1基因缺失本人构建Δirp1-CΔirp1，irp1基因缺失后回补本人构建X7213自杀性质粒pRE112宿主菌，DAP-实验室保存质粒PlasmidspRE112pGP704自杀性质粒，pir依赖，包含oriT，oriV，sacB，Cmr实验室保存pREΔirp1pRE112自杀性质粒和irp1上下游序列，包含Cmr本人构建pEASY-T1克隆载体，包含Ampr，Kanr实验室保存pREΔirp1-CpRE112自杀性质粒，irp1及其上下游序列，包含Cmr本人构建2.1.2主要试剂及仪器主要试剂及仪器，分别见表2-2和2-3。表2-2主要试剂Table2-2Mainreagents主要试剂Mainreagents生产厂家ManufacturerPrimerSTARMaxPremix（2X）宝日医生物技术（北京）有限公司Taq酶、T4连接酶、内切酶宝日医生物技术（北京）有限公司氯霉素、氨苄西林粉末快速感受态细胞制备试剂盒（一步法）上海生工生物工程公司上海生工生物工程公司一站式DNA/RNA小量提取试剂盒上海生工生物工程公司UNIQ-10柱式微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒上海生工生物工程公司pEASY-T1CloningVector北京全式金公司
第二章大肠埃希菌缺失株E4Δirp1和回补株E4Δirp1-C的构建和鉴定13物送去生物公司测序，将测序结果正确的质粒命名为pREΔirp1。（4）缺失株Δirp1的筛选无痕缺失突变株筛选原理，如图2-2，具体操作如下：A.含质粒pREΔirp1的X7213与亲本株E4共培养（单交换）取供体菌X7213100μL（含pREΔirp1）和受体菌大肠埃希菌E450μL，置于含500μL无菌LB液体的试管中（含DAP），37℃恒温摇床过夜摇菌，涂布于含有50μg/mL氯霉素的LB固体平板上，37℃恒温培养箱过夜培养，次日挑取单菌落PCR进行鉴定。B.基因缺失株的筛选和鉴定（双交换）PCR条带大小和测序结果正确的即为阳性接合子，于无盐LB液体（含10%蔗糖）中连续传代3-5代，取最后一代菌液稀释涂板，37℃恒温培养箱过夜培养，次日挑取单菌落进行PCR和测序鉴定，PCR条带大小和测序结果都正确的菌株即为突变株，命名为E4Δirp1。图2-2缺失株E4Δirp1构建原理示意图Figure2-2TheschematicdiagramofconstructingE4Δirp1deletionstrain2.2.6回补株E4Δirp1-C的构建为了确定后续试验得到的结果差异是由irp1基因的缺失所致，本试验使用自杀性质粒介导同源重组的方法构建了缺失株E4Δirp1的回补株E4Δirp1-C。使用irp1-A-F和irp1-B-R作为上下游引物、E4基因组为模板进行扩增，可以得到约1953bp的片段，其中包括irp1基因及其上下游同源臂，将自杀性质粒与所得片段连接转化后，最后用两步同源重组的方法即可得到回补株E4Δirp1-C，具体操作步骤详见2.2.5（周秀娟2015）。2.3结果2.3.1基因敲除菌株的筛选14株大肠埃希菌（E1-E14）经过氯霉素检测和irp1基因的PCR筛选，菌株E1、
【参考文献】：
期刊论文
[1]大肠杆菌的研究综述[J]. 殷泽禄,万虎. 甘肃畜牧兽医. 2019(05)
[2]奶牛子宫内膜炎研究进展[J]. 罗光建,王萍,李莹杰,刘英. 今日畜牧兽医. 2019(02)
[3]PEC HPI irp2基因缺失株的构建及蛋白结构功能预测[J]. 刘超英,吴程华,高洪,严玉霖,富国文,赵汝. 中国兽药杂志. 2018(02)
[4]大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2毒力岛研究进展[J]. 尹磊,祁克宗,宋祥军,涂健. 微生物学通报. 2017(12)
[5]猪肠外致病性大肠杆菌对氟喹诺酮类耐药机制研究[J]. 王斌,袁定胜,李金良,李思聪,杨锐,张敏,李旭廷. 黑龙江畜牧兽医. 2017(07)
[6]奶牛子宫内膜炎病因学研究进展[J]. 那立冬,王东升,董书伟,张世栋,闫宝琪,杨洪早,桑梦琪,严作廷. 动物医学进展. 2016(09)
[7]大肠埃希菌强毒力岛核心基因fyuA研究进展[J]. 王庄,张泽辉,刘耀川,张德显,刘明春. 动物医学进展. 2016(08)
[8]副溶血弧菌calR的基因敲除株与回补株构建[J]. 侯书宁,孟彦言,朱文君,张凌宇,周冬生,张义全,黄新祥. 军事医学. 2016(05)
[9]奶牛子宫内膜炎诊疗研究进展[J]. 彭津津,雍康,张传师. 黑龙江畜牧兽医. 2016(02)
[10]肠毒性大肠杆菌gspD基因敲除以及对LT毒素分泌的影响[J]. 鲁曦,傅恩清,潘蕾,穆德广,李王平,金发光. 基因组学与应用生物学. 2015(12)
博士论文
[1]我国北方地区犊牛腹泻大肠杆菌HPI分子结构组成及其菌蜕的研究[D]. 孙武文.吉林农业大学 2016
[2]沙门氏菌C1血清组特异基因功能分析[D]. 周秀娟.上海交通大学 2015
硕士论文
[1]克氏柠檬酸杆菌的生物学特性及其鞭毛素基因fliC的功能[D]. 王乐.西北农林科技大学 2019
[2]大肠埃希菌生物被膜对抗生素和消毒剂药效的影响[D]. 范玉堂.西北农林科技大学 2019
[3]香樟精油对奶牛子宫内膜炎大肠杆菌生物膜的抑制作用研究[D]. 付敬敬.河南农业大学 2018
[4]K88ac+产肠毒素大肠杆菌强毒力岛HPI缺失株的构建及相关毒力功能探析[D]. 许绵.扬州大学 2017
[5]鸡肉中大肠杆菌生物膜的污染情况及石榴皮单宁对大肠杆菌生物膜的干预作用[D]. 杨沁南.西北农林科技大学 2016
[6]K88ac+大肠杆菌减毒株的构建及其在小鼠体内的初步应用[D]. 余树培.扬州大学 2016
[7]K88ac+产肠毒素大肠杆菌sRNA伴侣蛋白Hfq毒力相关功能的研究[D]. 胡会杰.扬州大学 2016
[8]猪源肠外致病性大肠杆菌六型分泌系统hcp基因缺失株的构建及功能研究[D]. 彭颖.华中农业大学 2015
[9]大肠杆菌毒力岛HPI相关基因缺失株的研究[D]. 王晨娟.扬州大学 2012
[10]大肠杆菌O157：H7 O岛缺失规律及O45岛基因缺失对STX2表达的影响[D]. 李贝贝.山西医科大学 2007
本文编号：3369903
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3369903.html
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