多功能SAM依赖性酶LepI和海栖热袍菌乙酰羟酸合酶的结构生物学研究

发布时间：2021-09-30 16:24

　　酶是生命体必不可少的重要物质,为生物体内发生多种催化反应提供了重要保障。随着深入的探究,生物酶在生产生活中的应用越来越重要。周环反应在工业合成中应用广泛,但能够催化周环反应的酶很少,目前已报道了黄曲霉中有具有相似活性的酶,对其进行探究将为工业生产提供重要价值。极端环境下嗜热菌的典型生物海栖热袍菌在合成生物学中的应用越来越广泛,而对于其乙酰羟酸合酶的研究将为支链氨基酸生产提供新的方向。本文开展了对两种重要酶的结构生物学研究,首先是黄曲霉生物合成leporinB途径中生成吡喃环的关键酶——多功能SAM依赖性酶LepI。我们通过构建重组质粒并且进行表达纯化,得到纯度高、均一性好的蛋白后进行结晶实验,在筛选了 768个池液条件后,发现有晶体生长。对相关的结晶条件进行优化,通过X-射线衍射收集有效的衍射数据。在没有同源结构的情况下,通过对硒代蛋白进行表达纯化和结晶实验,收集到硒代晶体的衍射数据后成功解析LepI的蛋白结构。随后通过结构分析,序列比对和分子对接实验提出了LepI的催化机理。本文研究的另一个酶是海栖热袍菌的乙酰羟酸合酶,乙酰羟酸合酶是生物合成支链氨基酸过程中的第一个限速酶,该酶由两个... 

【文章来源】：北京化工大学北京市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：83 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－］?ＬｅｐｏｒｉｎＢ的部分合成途径ｔ１６］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｐａｒｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐａｔｈｗａｙ?ｏｆ?Ｌｅｐｏｒｉｎ?Ｂ［１６］??

适当延长时间，有的胶浓度较高电流可能过高可以适当??降低电压。??胶的染脱色：结束后，拆掉胶板，用考马斯染色，微波炉加热２?ｍｉｎ，静置??一会，重复２－３次可以使染色效果更好。随后用脱色液脱色，此过程也可以用??微波炉加热，与染色过程相同，能从胶上看到条带时可先初步了解蛋白表达纯??化的情况，更换脱色液继续脱色，即可得到清晰明了的胶结果。??ＮＩ?Ｉ?Ｓ?Ｐ?ＢＡＷ?Ｅ?ＢＡＥ?Ｍ??ｍｍｍ??？?１?．?＇??ｍｍ，：??＇?參?：ｆ??ｗ?、?＊?－爲’／??图２－２?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ示意图??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ??如图２－２所示，对图中样品说明：ＮＩ表示诱导前，Ｉ表示诱导后，Ｓ表示破??胞高速离心后的上清，Ｐ表示破胞高速离心后的沉淀，ＢＡＷ表示洗杂结束后的??Ｂｅａｄｓ，?Ｅ表示洗脱的蛋白，ＢＡＥ表示洗脱完成后的ｂｅａｄｓ。从图上ＮＩ和Ｉ对比??可以明显的看到有一条带在诱导后出现了，在Ｓ中也有，说明目的蛋白成功表达??且是可溶性蛋白；同时在镍柱上大量挂柱，经过洗杂蛋白纯度也有所提高，并??且能够被洗脱下来，虽然ＢＡＥ上有少量蛋白残留，但是绝大多数蛋白都被很好??的洗脱了。??２．?３蛋白质结晶实验??２１??

?＾＾３５?｜：：雜?￣?ＧＳＴ??；響．：暴；．，，??｜。鄭，?ｉ?？?Ｓ??聲??＿９?？?１６?１Ｊ?１８?１９＿２０，??＾?ｎ??????＂仏￣＊■＊＊?Ｃｏｎｄ??Ｆｒａｃｔｉｏｎ??Ａ??．／?—Ｌ?丄?Ｌ?Ｌ?Ｌ?ｋ?Ｌ?ｊ：?ｂ?ｇ?ｋ．Ｌ?ｆｃ?Ｌ，?ｋ?Ｌ?ｈ?Ｕｆ；ｌ?????ｔ?，?＞?＞?＊?ｔ?＜?ｔ?？?？?ｉｏ?ｉｉ?ｕ?ｕ?ｍ?ｉｔ?ｗ?ｉｉ?ｉｅ?ｉｔ?？?２ｉ?ａ??图３－１?ＬｅｐＩ少量表达纯化结果??Ｆｉｇｕｒｅ?３－１?Ｔｈｅ?ｔｅｓｔ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ＬｅｐＩ??ＬｅｐＩ的氨基酸数为１－３８７分子量约为４３?ＫＤａ，ＧＳＴ标签大小在２６?ＫＤａ。??从带ＧＳＴ标签的ＬｅｐＩ试表达的蛋白胶图３－１?ａ上可以明显的看到诱后样品Ｉ中??有蛋白被诱导出来，且在后续的纯化过程中洗杂结束后的亲和层析柱上也明显??富集了这个蛋白，和蛋白Ｍａｒｋｅｒ对比发现蛋白在６０－８０?ＫＤａ之间，和带ＧＳＴ??标签的ＬｅｐＩ基本相符。一般用来做结晶实验的蛋白会切掉ＧＳＴ标签，防止标??签过大影响蛋白结晶。在经过ＰＰ酶酶切后跑胶，从胶图３－ｌｂ上Ｅ和ＢＡＷ对??比可以看到蛋白切掉标签后大小发生了明显的变化，在洗脱后的层析柱样品中??有三个蛋白，从上到下依次是是少量没有切掉标签的ＬｅｐＩ，ＰＰ酶或者未洗脱完??全的ＬｅｐＩ?（二者分子量相近，在胶图上不能完全分开），ＧＳＴ标签。将酶切后??３０??


本文编号：3416239