AEP环化酶的高效原核诱导表达与活性检测体系的建立

发布时间：2021-09-30 23:13

　　天冬酰胺内切酶（AEPs）可催化短肽形成结构异常稳定的环肽,其具有药物设计框架的应用前景.将来源于白花蛇舌草（Oldenlandia affinis）中AEP（Oa AEP1b）环化酶（cyclase）基因采用融合标签表达的策略在大肠杆菌菌株BL21中进行诱导表达,并比较了不同的融合标签麦芽糖结合蛋白（MBP）,N-utilization substance A（NusA）,小泛素修饰蛋白（SUMO）,绿色荧光蛋白（GFP）以及泛素（ubiquitin）对AEP环化酶表达量的影响.结果表明,MBP标签对AEP的表达促进作用最强,达到（3. 6±0. 05） mg/L,是目前文献报道的2倍.体外酶切实验证实该环化酶可对融合表达的底物蛋白MBP-Kalata B1-6*His-GST进行有效切割,但连接反应过程有待验证.本研究对AEP环化酶进行肽工程研究与应用奠定了较好的基础,并提供了一套高效的研究工具. 

【文章来源】：湖北大学学报(自然科学版). 2020,42(01)

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

AEP环化酶PCR扩增

p ET-28a载体酶切图

融合标签可促进目的蛋白的可溶性表达，但在验证目的蛋白生物活性时，为了避免额外的氨基酸序列对目的蛋白相关特性的影响，往往需要对融合标签进行去除．本研究中，我们在融合标签和AEP环化酶之间加入了HRV 3V蛋白酶的底物识别位点，因此，可以按照1.2.5利用HRV 3V切割MBP-AEP-6*His融合蛋白和SUMO-AEP-6*His融合蛋白中底物序列LEVLFQ/GP来分离融合标签和AEP环化酶．反应结束后将整个切割反应体系用Ni柱进行第二次纯化．因AEP环化酶的C端含有6*His标签，故可以用来纯化AEP环化酶，从而将融合标签蛋白和AEP进行有效的分离，得到纯AEP环化酶．将Elution Buffer洗脱下来的蛋白质用SDS-PAGE检测，结果显示(图4),SDS-PAGE中AEP条带的大小与预测的49.7 kD大小一致，由此分别成功得到了去掉融合标签MBP和SUMO的纯的AEP环化酶，并根据Bradford方法测其蛋白质浓度，其蛋白浓度为分别为(3.6±0.05)mg/L和(2.8±0.05)mg/L.图4 移除融合标签的AEP环化酶的SDS-PAGE分析


本文编号：3416811