酿酒酵母中基于CRISPR/dCas9的基因转录调控工具的开发与应用
发布时间：2021-10-22 15:19
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是重要的模式真核微生物,广泛用于基础研究和工业发酵。基于CRISPR/dCas9系统开发的转录调控方法具有可编程、多重性和正交性等优点,在酿酒酵母的基因调控、功能基因组学、代谢工程等研究领域具有巨大潜力。本文关注酿酒酵母中CRISPR/dCas9基因转录调控工具的研究进展,阐述了不同转录调节结构域对dCas9或gRNA活性的调节,设计与优化dCas9和gRNA表达的方法,影响CRISPR/dCas9系统转录调控效率、特异性和通量的靶向性因素,最后总结了该工具在酿酒酵母代谢工程中的应用,并对该技术的未来发展提出了展望。
【文章来源】：生物技术通报. 2020,36(04)北大核心CSCD
【文章页数】：12 页
【部分图文】：
利用多条gRNA进行协同、多重或多模式转录调控
调节gRNA的转录水平也是优化CRISPR/dCas9转录调控性能的重要方法。首先,利用不同类型的天然启动子可以用来调节gRNA的转录水平。与RNA聚合酶相对应,真核生物启动子可分为I型(rRNA)、II型(mRNA)和III型(snoRNA、tRNA等)。由于II型启动子会在gRNA的5"和3"端添加额外的核苷酸从而干扰其正常功能,因此一般利用III型启动子驱动gRNA的表达,如PSNR52和PRPR1等[6,21,23]（表1）。然而，由于III型启动子的转录本长度较短，为了提高gRNA设计和表达的灵活性，Gao等[52]通过在gRNA两端分别融合锤头型核酶（Hammerhead-type ribozymes）和HDV核酶（Hepatitis delta virus）在酿酒酵母细胞中实现了由II型PADH1启动子驱动的gRNA的表达（表1）。这种含有核酸酶的g RNA称为RGR(Ribozyme-flanked gRNA）。基于该设计，Deaner等[18]利用II型的PTEF1启动子将gRNA的转录水平比III型的PSNR52启动子提高了3.88倍，显著提高了dCas9-VPR介导的转录抑制效率（gRNA靶点的位置效应，见下文）。而Gander等[53]利用最小化PCYC1启动子驱动RGR的转录，基于dCas9-Mxi1建立的非逻辑门显示了最小的泄漏并具有数字响应，为更加复杂的遗传电路研究奠定了基础。除组成型启动子外，还可以改造天然的III型启动子使其具有对环境因素变化响应的能力，从而增强dCas9调控工具的可控性。例如，研究人员通过在III型PRPR1启动子中整合Tet操纵子结合位点，实现无水四环素对gRNA的诱导转录，以及2-20倍的转录调控动态范围[21,38,42,54]。这些不同启动子驱动的多种设计方案为gRNA的表达量、通量和对gRNA表达的控制提供了有力的工具和多样的选择。1.3 针对靶向性能的设计与优化
与dCas9融合多个转录调控蛋白结构域或gRNA融合多个适配子的思路类似,靶向同一目的基因的多条gRNA能够协同调控靶基因的转录(图3-A)。Farzadfard等[21]组合使用两条gRNA时将转录抑制的效率从2倍提高到了7倍,Deaner等[18]同样利用两条gRNA提高了dCas9-VPR介导的转录抑制水平。此外,还可以通过在启动子内人工合成相同的靶序列,实现多条单一gRNA介导的协同调控。Farzadfard等[21]利用含有12个gRNA结合位点的合成型启动子,将dCas9-VP64介导的转录激活提高了70倍,Gilbert等[23]利用含有7个Tet操纵子结合位点的合成型启动子,将dCas9介导的转录抑制提高了115倍。利用靶向多个目的基因的多条gRNA或scRNA可实现多重性(Multiplex)的转录调控(图3-B)。Jensen等[38]利用dCas9与scRNA将Mxi1和VPR等转录调控结构域靶向类胡萝卜素和三酰甘油生物合成途径的多个基因,显著增加了相关产物的产量。Ferreira等[54]利用来自绿脓假单胞菌的核糖核酸内切酶Csy4,实现了PRPR1启动子驱动单条转录本中3个gRNA的转录和释放,实现了同时对OLE1,HGM1和ACS1等多个基因进行转录调控。此外,基于CRISRP/dCas9工具中组成元件相互作用的特异性,可以设计彼此正交的gRNA,在同一细胞中对多个目标基因实现不同模式的基因调控。例如,利用不同RNA适配子与其结合蛋白的特异性识别,Zalatan等[39]设计彼此正交、与不同转录调控因子结合的scRNA序列(图3-B),在同一菌株中对紫色杆菌素合成通路的不同分支的基因进行转录抑制和转录激活,通过调控代谢流实现了不同产物的定向合成。利用不同Cas蛋白识别不同PAM序列的特点,Lian等[19]测试了不同来源的dCas蛋白和多种转录激活或抑制结构域的组合,构建了基于dLbCpf1-VP、dSpCas9-RD1152和SaCas9的酿酒酵母三相基因调控策略,称为CRISPR-AID(Transcriptional Activation,transcriptional Interference,and gene Deletion)。作者设计了彼此正交、与不同Cas蛋白对应的gRNA序列(图3-C),在同一细胞中可以实现对多个目的基因进行转录抑制、转录激活、基因敲除等不同模式的调控。综上,多重gRNA的设计与使用能够提高单个靶基因的转录调控能力,实现多个靶基因的单向多重调控,还能够利用正交性设计系统实现靶基因的多重和多模式调控。通过增加可同时操作的基因靶点和调控模式,有助于从多个工程化改造靶点中快速找到最优的调控策略及其组合,即利用组合式优化为复杂基因线路、合成途径和细胞代谢的设计和改造提供有力工具。
本文编号：3451363
【文章来源】：生物技术通报. 2020,36(04)北大核心CSCD
【文章页数】：12 页
【部分图文】：
利用多条gRNA进行协同、多重或多模式转录调控
调节gRNA的转录水平也是优化CRISPR/dCas9转录调控性能的重要方法。首先,利用不同类型的天然启动子可以用来调节gRNA的转录水平。与RNA聚合酶相对应,真核生物启动子可分为I型(rRNA)、II型(mRNA)和III型(snoRNA、tRNA等)。由于II型启动子会在gRNA的5"和3"端添加额外的核苷酸从而干扰其正常功能,因此一般利用III型启动子驱动gRNA的表达,如PSNR52和PRPR1等[6,21,23]（表1）。然而，由于III型启动子的转录本长度较短，为了提高gRNA设计和表达的灵活性，Gao等[52]通过在gRNA两端分别融合锤头型核酶（Hammerhead-type ribozymes）和HDV核酶（Hepatitis delta virus）在酿酒酵母细胞中实现了由II型PADH1启动子驱动的gRNA的表达（表1）。这种含有核酸酶的g RNA称为RGR(Ribozyme-flanked gRNA）。基于该设计，Deaner等[18]利用II型的PTEF1启动子将gRNA的转录水平比III型的PSNR52启动子提高了3.88倍，显著提高了dCas9-VPR介导的转录抑制效率（gRNA靶点的位置效应，见下文）。而Gander等[53]利用最小化PCYC1启动子驱动RGR的转录，基于dCas9-Mxi1建立的非逻辑门显示了最小的泄漏并具有数字响应，为更加复杂的遗传电路研究奠定了基础。除组成型启动子外，还可以改造天然的III型启动子使其具有对环境因素变化响应的能力，从而增强dCas9调控工具的可控性。例如，研究人员通过在III型PRPR1启动子中整合Tet操纵子结合位点，实现无水四环素对gRNA的诱导转录，以及2-20倍的转录调控动态范围[21,38,42,54]。这些不同启动子驱动的多种设计方案为gRNA的表达量、通量和对gRNA表达的控制提供了有力的工具和多样的选择。1.3 针对靶向性能的设计与优化
与dCas9融合多个转录调控蛋白结构域或gRNA融合多个适配子的思路类似,靶向同一目的基因的多条gRNA能够协同调控靶基因的转录(图3-A)。Farzadfard等[21]组合使用两条gRNA时将转录抑制的效率从2倍提高到了7倍,Deaner等[18]同样利用两条gRNA提高了dCas9-VPR介导的转录抑制水平。此外,还可以通过在启动子内人工合成相同的靶序列,实现多条单一gRNA介导的协同调控。Farzadfard等[21]利用含有12个gRNA结合位点的合成型启动子,将dCas9-VP64介导的转录激活提高了70倍,Gilbert等[23]利用含有7个Tet操纵子结合位点的合成型启动子,将dCas9介导的转录抑制提高了115倍。利用靶向多个目的基因的多条gRNA或scRNA可实现多重性(Multiplex)的转录调控(图3-B)。Jensen等[38]利用dCas9与scRNA将Mxi1和VPR等转录调控结构域靶向类胡萝卜素和三酰甘油生物合成途径的多个基因,显著增加了相关产物的产量。Ferreira等[54]利用来自绿脓假单胞菌的核糖核酸内切酶Csy4,实现了PRPR1启动子驱动单条转录本中3个gRNA的转录和释放,实现了同时对OLE1,HGM1和ACS1等多个基因进行转录调控。此外,基于CRISRP/dCas9工具中组成元件相互作用的特异性,可以设计彼此正交的gRNA,在同一细胞中对多个目标基因实现不同模式的基因调控。例如,利用不同RNA适配子与其结合蛋白的特异性识别,Zalatan等[39]设计彼此正交、与不同转录调控因子结合的scRNA序列(图3-B),在同一菌株中对紫色杆菌素合成通路的不同分支的基因进行转录抑制和转录激活,通过调控代谢流实现了不同产物的定向合成。利用不同Cas蛋白识别不同PAM序列的特点,Lian等[19]测试了不同来源的dCas蛋白和多种转录激活或抑制结构域的组合,构建了基于dLbCpf1-VP、dSpCas9-RD1152和SaCas9的酿酒酵母三相基因调控策略,称为CRISPR-AID(Transcriptional Activation,transcriptional Interference,and gene Deletion)。作者设计了彼此正交、与不同Cas蛋白对应的gRNA序列(图3-C),在同一细胞中可以实现对多个目的基因进行转录抑制、转录激活、基因敲除等不同模式的调控。综上,多重gRNA的设计与使用能够提高单个靶基因的转录调控能力,实现多个靶基因的单向多重调控,还能够利用正交性设计系统实现靶基因的多重和多模式调控。通过增加可同时操作的基因靶点和调控模式,有助于从多个工程化改造靶点中快速找到最优的调控策略及其组合,即利用组合式优化为复杂基因线路、合成途径和细胞代谢的设计和改造提供有力工具。
本文编号：3451363
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