分子改造提高融合酶特性的研究

发布时间：2021-10-30 09:26

　　海藻糖是一种非还原性二糖;是通过1,1糖苷键连接两个吡喃型葡萄糖单体所构成的;化学名称为α-D-吡喃葡糖基-α-D-吡喃葡糖苷（α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside）,被称为生命之糖。海藻糖的化学性质很稳定,在生物体内具有抗脱水功能,因此生物在干旱、寒冷、高盐碱等胁迫条件下,海藻糖能够保护生物膜以及蛋白质等减少伤害,对生物体具有非常好的非特异性保护作用。由于海藻糖的制备工艺比较复杂,生产成本高,因此海藻糖的市场应用受到一定的阻碍。本实验以蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus的β-淀粉酶和海藻糖合酶为出发点,通过替换海藻糖合酶生产菌以及改变融合酶的连接方式,构建了β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶,并对融合酶的一些酶学性质进行初步的探索。本研究内容主要包括以下几方面:（1）β-淀粉酶与不同来源的海藻糖合酶双功能融合酶的构建与表达:通过PCR分别克隆了来源于菌种Pseudomonas stutzeri、Thermobaculum terrenum、Pseudomonas putide P06的海藻糖合酶基因,并且通过连接肽（EAAAK）3构建了β-淀... 

【文章来源】：齐鲁工业大学山东省

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 海藻糖的简介
        1.1.1 海藻糖的结构
        1.1.2 海藻糖的特性
        1.1.3 海藻糖的合成方式
        1.1.4 海藻糖的应用
    1.2 海藻糖合酶的研究进展
        1.2.1 海藻糖合酶的简介
        1.2.2 海藻糖合酶的作用机理
        1.2.3 海藻糖合酶基因工程研究进展
    1.3 融合酶的研究进展
        1.3.1 融合酶的简介
        1.3.2 融合酶的连接方法
    1.4 蛋白异源表达与纯化技术
        1.4.1 蛋白异源表达与纯化的简介
        1.4.2 蛋白异源表达体系分类
        1.4.3 蛋白纯化流程简介
        1.4.4 蛋白纯化技术的现状
    1.5 圆二色光谱的研究进展与应用
        1.5.1 圆二色光谱技术的简介
        1.5.2 圆二色光谱技术在测定蛋白方面的应用
    1.6 立题的背景和研究意义
第2章 β-淀粉酶与不同来源的海藻糖合酶融合酶的构建与表达
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 菌种和质粒
        2.2.2 主要仪器与设备
        2.2.3 分子生物学试剂与酶
        2.2.4 主要试剂
        2.2.5 相关溶液与培养基的配置
    2.3 实验方法
        2.3.1 重组质粒pET-28a-ba的构建
            2.3.1.1 质粒pET-28a的提取
            2.3.1.2 蜡样芽孢杆菌基因组DNA的提取
            2.3.1.3 表达引物的设计
            2.3.1.4 大肠杆菌E.coli DH5α感受态的制备
            2.3.1.5 β-淀粉酶基因的克隆与转化
        2.3.2 β-淀粉酶与不同来源的海藻糖合酶融合酶的构建
            2.3.2.1 引物的设计
            2.3.2.2 不同来源海藻糖合酶基因(ts)的扩增
            2.3.2.3 重组质粒pET-28a-ba的提取
            2.3.2.4 不同来源海藻糖合酶基因与质粒pET-28a-ba的连接与转化
            2.3.2.5 阳性重组子的验证
        2.3.3 融合酶的诱导表达与纯化以及融合蛋白浓度的测定(以重组菌株 E.coli BL21(pET-28a-bap3ts Ps)为例)
            2.3.3.1 融合酶的诱导表达及酶活验证
            2.3.3.2 融合酶Ni-NTA亲和层析纯化及蛋白浓度的测定
        2.3.4 重组菌株酶活性质的测定
            2.3.4.1 融合酶最适温度的测定
            2.3.4.2 融合酶最适pH的测定
            2.3.4.3 不同金属离子对融合酶的影响
            2.3.4.4 融合酶动力学参数的测定(BL21(pET-28a-bap3ts Ps)以及BL21(pET-28a-bap3 ts Tt))
    2.4 实验结果与讨论
        2.4.1 融合酶重组质粒的构建过程
        2.4.2 空载pET-28a质粒的提取
        2.4.3 β-淀粉酶基因(ba)的克隆
        2.4.4 重组质粒pET-28a-ba阳性重组子的验证
        2.4.5 PCR扩增不同来源的海藻糖合酶基因
        2.4.6 重组融合酶的构建(以重组质粒pET-28a-bap3ts Ps为例)
        2.4.7 融合酶的表达与催化
        2.4.8 融合酶酶活特性的测定
    2.5 本章小结
第3章 利用抗蛋白酶降解连接肽的融合酶的构建与表达
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 工程菌及质粒
        3.2.2 主要仪器
        3.2.3 分子生物学试剂与酶
        3.2.4 主要试剂
        3.2.5 培养基与相关溶液的配置
    3.3 实验方法
        3.3.1 抗蛋白酶降解的连接肽以及引物的设计
        3.3.2 质粒pET-28a-bap3ts Ps和 pUC57-shishi-17 的提取
        3.3.3 抗蛋白酶降解连接肽替换片段的连接
            3.3.3.1 连接肽替换片段(SS17)的扩增
            3.3.3.2 质粒pUC57-shishi-17与pET-28a-bap3ts Ps 的双酶切
            3.3.3.3 目的片段与质粒pET-28a-bap3ts Ps的连接
        3.3.4 阳性重组子的检测与验证
        3.3.5 融合酶的诱导表达及酶活验证
        3.3.6 重组融合酶BL21(pET-28a-bap4ts Ps)酶活特性的测定
            3.3.6.1 重组融合酶最适温度的测定
            3.3.6.2 重组融合酶最适pH的测定
            3.3.6.3 不同金属离子对重组融合酶酶活的影响
            3.3.6.4 圆二色光谱检测蛋白二级空间的变化(重组融合酶BL21(pET-28a-bap4tsPs)与原始融合酶BL21(pET-28a-bap3tsPs)以及单酶比较)
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 融合酶重组质粒的构建
        3.4.2 连接肽替换片段(SS17)的扩增
        3.4.3 质粒pUC57-shishi-17与pET-28a-bap3ts Ps的双酶切
        3.4.4 重组质粒pET-28a-bap4ts Ps阳性重组子的验证
        3.4.5 重组融合酶的诱导表达与酶活验证
        3.4.6 重组融合酶酶活特性的检测
    3.5 本章小结
第4章 利用插入融合的方式构建融合酶
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 工程菌及质粒
        4.2.2 主要仪器
        4.2.3 分子生物学试剂与酶
        4.2.4 主要试剂
        4.2.5 培养基与相关溶液配置
    4.3 实验方法
        4.3.1 插入位点以及插入融合主体与客体的选择
        4.3.2 表达引物的设计
        4.3.3 海藻糖合酶基因的扩增
        4.3.4 重组质粒pET-28a-ba的线性化
        4.3.5 重组质粒pET-28a-bats Ps的构建与转化
        4.3.6 阳性重组子的检测与验证
        4.3.7 重组菌株E. coli BL21(pET-28a-bats Ps)的异源表达与酶活验证
    4.4 实验结果
        4.4.1 PCR 扩增海藻糖合酶基因(tsPs)
        4.4.2 载体pET-28a-ba的线性化
        4.4.3 阳性重组子的鉴定
        4.4.4 重组融合酶BL21(pET-28a-bats Ps)的蛋白表达与酶活验证
    4.5 本章小结
第5章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
致谢
在校期间主要研究成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]犬干扰素α2与犬白蛋白融合基因在昆虫细胞中的表达与活性分析[J]. 王晶宇,欧阳伟,钱晶,王晓丽,夏兴霞,诸玉梅,毕振威,王永山.  畜牧兽医学报. 2019(10)
[2]聚乙二醇沉淀联用双水相萃取法纯化蛋清溶菌酶的研究[J]. 闻崇炜,赵烨清,石莉,欧阳臻.  生物技术通报. 2017(05)
[3]蔗糖浓度对渗透休克法提取细胞周质重组蛋白的影响[J]. 郭建华.  安徽农业科学. 2017(04)
[4]大肠杆菌产海藻糖合成酶发酵条件优化[J]. 杨梅玉,赵伟,陈文娜,张曰辉,曹大鹏.  中国酿造. 2015(10)
[5]哺乳动物细胞表达外源基因常用病毒载体的研究进展[J]. 谢宝明,魏圆圆,乔自林,于国伟,李向茸,冯玉萍,令世鑫,马忠仁,柏家林.  西北民族大学学报(自然科学版). 2015(01)
[6]海藻糖在日化领域的应用研究进展[J]. 刘宗利,王乃强,刘峰,李克文,柏帅.  精细与专用化学品. 2015(02)
[7]海藻糖的特性、功能及应用[J]. 靳文斌,李克文,胥九兵,张友亮,肖兆玲,张倩,刘开昌,龚魁杰.  精细与专用化学品. 2015(01)
[8]海藻糖生物合成及应用研究进展[J]. 曲茂华,张凤英,何名芳,陈卫平.  食品工业科技. 2014(16)
[9]反复冻融法破碎基因工程受体细胞的研究[J]. 李亚君,姚萍,王春侠,宋莉.  生物技术世界. 2013(04)
[10]融合酶的设计和应用研究进展[J]. 黄子亮,张翀,吴希,苏楠,邢新会.  生物工程学报. 2012(04)



本文编号：3466484