L-天冬氨酸β-脱羧酶分子改造及其催化合成L-高苯丙氨酸的研究
发布时间：2021-11-09 16:23
L-氨基酸是非常重要的医药中间体,其合成方法受到广泛关注。来源于Pseudomonas dacunhae的L-天冬氨酸β-脱羧酶（ABDC）可以催化L-天冬氨酸发生β-脱羧反应生成L-丙氨酸并释放二氧化碳,目前该酶已用于L-丙氨酸的工业化生产。1963年,Wilson和Kornberg首次报道了来源于Achromobscter的L-天冬氨酸β-脱羧酶可以催化苏式和赤式-β-羟基-DL-天冬氨酸发生β-脱羧作用生成L-丝氨酸。由此受到启发,我们猜想ABDC是否能够催化其它天冬氨酸衍生物合成更多类型的L-氨基酸?因此,本文的研究目的首先是探索ABDC催化的底物谱范围,进一步地通过半理性设计对其进行分子改造,提高其合成L-高苯丙氨酸等L-氨基酸的能力。首先,我们对天然酶催化的底物谱进行探索,通过UPLC-MS鉴定发现天然酶可以催化3-位取代的天冬氨酸-β-羧基脱除反应。测定了酶对3-位取代天冬氨酸衍生物的比活力,发现天然酶更倾向于催化3-羟基-DL-天冬氨酸的β-脱羧,但其比活力仅为天然底物L-天冬氨酸的千分之一。其次,鉴于天然酶对非天然底物催化效率偏低的问题,我们以化学合成并拆分获得的大位...
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．１含有手性Ｌ－氨基酸结构单元的药物??Ｆｉｇ．?１．１?Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ?ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ?ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ?ｃｈｉｒａｌ?Ｌ＇ａｍｉｎｏ?ａｃｉｄｓ．??
与讨论??２．４．１蛋白纯化??如上２．３．６的方法，用含不同浓度咪唑的纯化缓冲液洗脱镍柱，己知目的蛋白的分??子量为６０?ｋＤａ左右。洗脱条件如下：（１）７５?ｍＭ?（１５％?Ｂ）咪唑用来洗脱杂蛋白；（２）２０％??Ｂ－６０％?Ｂ洗脱液中均含有目的蛋白，我们确定后期实验中用３００?ｍＭ?（６０％?Ｂ）咪唑洗脱??目的蛋白。（３）洗脱体积约３５?ｍＬ?（１７倍柱体积）基本可以将目的蛋白全部洗脱下来（图??２．３）。??ＫＤａ?Ｍｌ?２３４５６７８９?１０?１１??Ｉ?＂…—??图２．３蛋白质纯化电泳图??Ｆｉｇ．?２．３?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｅｌｕｅｎｔｓ?ｅｌｕｔｅｄ?ｂｙ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ｉｍｉｄａｚｏｌｅ．??Ｌａｎｅ?１：?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ；?Ｌａｎｅ?２：?ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ；?Ｌａｎｅ?３：?ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ；?Ｌａｎｅ?４：?５％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?５：?１５％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；??Ｌａｎｅ?６：?２０％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?７：?３０％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?８：?４０％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?９：?５０％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?１０：?６０％??Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?１１：?７０％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?Ｍ：?ｍａｒｋｅｒ．??２．４．２氨基酸与衍生化试剂ＧＩＴＣ的添加比例摸索??为保证ＨＰＬＣ检测氨基酸浓度的准确性，需要确保所有的氨基酸均被衍生化。因此，??我们对衍生化体系中氨基酸与ＧＩＴＣ的添加比例进行摸索。以Ｌ－天冬氨酸和Ｌ－丙氨酸为??例设计实验，如表２．
华东理工大学硕士学位论文?第２５页??２．４．４?Ｌ－天冬氨酸Ｐ－脱羧酶对非天然氨基酸底物的反应进程图??ｕＶｆｘｌ?００．０００）???，ｎ?３（／？，５＞甲基－ＤＬ－天冬氨酸丨；??２０?ｊ＼?八Ｌ－２－氣基丁酸??：?Ｌ－２－氨基丁酸标品／＼????０．０?２．５?５．０?７．５?１０．０?１２．５?ｍｉｎ??图２．５?甲基－ＤＬ－天冬氨酸的反应进程图??Ｆｉｇ．?２．５?Ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｐｒｏｇｒｅｓｓ?ｏｆ?ＳＣ／＾＾－ｍｅｔｈｙｌ－ＤＬ－ａｓｐａｒｔｉｃ?ａｃｉｄ．??商品化的３（／？，５＞甲基－ＤＬ－天冬氨酸和３（／？，５＞羟基－ＤＬ－天冬氨酸均为外消旋体，我们??以这两个底物为例，通过液相色谱监测其反应过程。经液相色谱分析，我们检测到３（／？，５＞??甲基－ＤＬ－天冬氨酸的两个峰，其峰面积基本相等。我们可以观察到其中一种构型的底物??在反应过程中逐渐减少，产物Ｌ－２－氨基丁酸的浓度逐渐增加（图２．５）。１９６４年，??Ｎｏｖｏｇｒｏｄｓｋｙ和Ｍｅｉｓｔｅｒ的研宄结果表明源于为ｅｃｏ／ｋ的天冬氨酸Ｐ－脱竣酶对??苏式－Ｐ－甲基－Ｌ－天冬氨酸没有活力ＩＨ，而本文中来源于Ｚ３?ＡｃｍＭｅ的天冬氨酸Ｐ－脱羧酶??则可以催化３（／？，５＞甲基－ＤＬ－天冬氨酸发生卜脱狻作用生成Ｌ－２－氨基丁酸，根据产物构型??可以推测发生反应的底物应为３（／？，５＞甲基－Ｌ－天冬氨酸（两种构型或其中的一种构型）。商??品化的３（／？，５＞羟基－ＤＬ－天冬氨酸是四种构型的混合物，由液相色谱图可知（图２．６），在６??ｈ后产物浓度不再增加，反应基本停止。２０１０年，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ利用快速动力学停留光谱
【参考文献】：
期刊论文
[1]L-天冬氨酸脱羧酶研究进展[J]. 高丽娟,裘娟萍. 工业微生物. 2007(05)
本文编号：3485684
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．１含有手性Ｌ－氨基酸结构单元的药物??Ｆｉｇ．?１．１?Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ?ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ?ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ?ｃｈｉｒａｌ?Ｌ＇ａｍｉｎｏ?ａｃｉｄｓ．??
与讨论??２．４．１蛋白纯化??如上２．３．６的方法，用含不同浓度咪唑的纯化缓冲液洗脱镍柱，己知目的蛋白的分??子量为６０?ｋＤａ左右。洗脱条件如下：（１）７５?ｍＭ?（１５％?Ｂ）咪唑用来洗脱杂蛋白；（２）２０％??Ｂ－６０％?Ｂ洗脱液中均含有目的蛋白，我们确定后期实验中用３００?ｍＭ?（６０％?Ｂ）咪唑洗脱??目的蛋白。（３）洗脱体积约３５?ｍＬ?（１７倍柱体积）基本可以将目的蛋白全部洗脱下来（图??２．３）。??ＫＤａ?Ｍｌ?２３４５６７８９?１０?１１??Ｉ?＂…—??图２．３蛋白质纯化电泳图??Ｆｉｇ．?２．３?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｅｌｕｅｎｔｓ?ｅｌｕｔｅｄ?ｂｙ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ｉｍｉｄａｚｏｌｅ．??Ｌａｎｅ?１：?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ；?Ｌａｎｅ?２：?ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ；?Ｌａｎｅ?３：?ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ；?Ｌａｎｅ?４：?５％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?５：?１５％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；??Ｌａｎｅ?６：?２０％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?７：?３０％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?８：?４０％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?９：?５０％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?１０：?６０％??Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?１１：?７０％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?Ｍ：?ｍａｒｋｅｒ．??２．４．２氨基酸与衍生化试剂ＧＩＴＣ的添加比例摸索??为保证ＨＰＬＣ检测氨基酸浓度的准确性，需要确保所有的氨基酸均被衍生化。因此，??我们对衍生化体系中氨基酸与ＧＩＴＣ的添加比例进行摸索。以Ｌ－天冬氨酸和Ｌ－丙氨酸为??例设计实验，如表２．
华东理工大学硕士学位论文?第２５页??２．４．４?Ｌ－天冬氨酸Ｐ－脱羧酶对非天然氨基酸底物的反应进程图??ｕＶｆｘｌ?００．０００）???，ｎ?３（／？，５＞甲基－ＤＬ－天冬氨酸丨；??２０?ｊ＼?八Ｌ－２－氣基丁酸??：?Ｌ－２－氨基丁酸标品／＼????０．０?２．５?５．０?７．５?１０．０?１２．５?ｍｉｎ??图２．５?甲基－ＤＬ－天冬氨酸的反应进程图??Ｆｉｇ．?２．５?Ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｐｒｏｇｒｅｓｓ?ｏｆ?ＳＣ／＾＾－ｍｅｔｈｙｌ－ＤＬ－ａｓｐａｒｔｉｃ?ａｃｉｄ．??商品化的３（／？，５＞甲基－ＤＬ－天冬氨酸和３（／？，５＞羟基－ＤＬ－天冬氨酸均为外消旋体，我们??以这两个底物为例，通过液相色谱监测其反应过程。经液相色谱分析，我们检测到３（／？，５＞??甲基－ＤＬ－天冬氨酸的两个峰，其峰面积基本相等。我们可以观察到其中一种构型的底物??在反应过程中逐渐减少，产物Ｌ－２－氨基丁酸的浓度逐渐增加（图２．５）。１９６４年，??Ｎｏｖｏｇｒｏｄｓｋｙ和Ｍｅｉｓｔｅｒ的研宄结果表明源于为ｅｃｏ／ｋ的天冬氨酸Ｐ－脱竣酶对??苏式－Ｐ－甲基－Ｌ－天冬氨酸没有活力ＩＨ，而本文中来源于Ｚ３?ＡｃｍＭｅ的天冬氨酸Ｐ－脱羧酶??则可以催化３（／？，５＞甲基－ＤＬ－天冬氨酸发生卜脱狻作用生成Ｌ－２－氨基丁酸，根据产物构型??可以推测发生反应的底物应为３（／？，５＞甲基－Ｌ－天冬氨酸（两种构型或其中的一种构型）。商??品化的３（／？，５＞羟基－ＤＬ－天冬氨酸是四种构型的混合物，由液相色谱图可知（图２．６），在６??ｈ后产物浓度不再增加，反应基本停止。２０１０年，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ利用快速动力学停留光谱
【参考文献】：
期刊论文
[1]L-天冬氨酸脱羧酶研究进展[J]. 高丽娟,裘娟萍. 工业微生物. 2007(05)
本文编号：3485684
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教材专著
