理性设计结合固定化提高CALB的热稳定性

发布时间：2022-01-07 13:47

　　南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B,CALB）是具有α/β水解酶折叠的丝氨酸水解酶。因其出色的催化性能,在食品、化工、能源等行业具有广泛的应用。然而野生型CALB较差的热稳定性使其在实际的生产应用中受到限制。为提高CALB的热稳定性,拓展CALB在工业中的应用,本论文采用理性设计结合固定化策略改造CALB,成功提高了CALB的热稳定性。此外,通过补料分批发酵,成功提高了CALB于毕赤酵母中的表达量。具体包括:（1）根据软件PoPMuSiC和FoldX计算各个位点突变后自由能的变化,以及氨基酸残基的空间位置,选择CALB潜在的热稳定性突变位点。经实验验证,突变位点A146G、A151P和L278M均能有效提高CALB的热稳定性。将这3个点突变进行组合后,组合突变体的热稳定性得到了进一步的提高,其中A146G-L278M在50°C的半衰期t_1/2为6.28 h,是野生型的1.35倍,T_m值提高了3.3°C,最适反应温度为50°C,比野生型提高了5°C,比活为野生型的2倍,动力学参数测定表明其在酯合成反应中... 

【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：55 页

【学位级别】：硕士

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本论文研究思路流程图

江南大学硕士学位论文14表2.4用于构建定点突变质粒的引物表Table2.4Listofprimersforconstructingsite-directedmutantplasmids引物名称序列(5’→3’)calb-FAATTGAATTCTTGCCATCTGGTTCTGATCCTGcalb-RAATTGCGGCCGCTTAAGGAGTAACAS50RATCTTTTGATAGAAACTGGATTCCATTGTS56MGATTCCATTGATGACTCAATTGGGTTACQ112LGTTTGGTTGCTTTGTGGGGTTTGA130CATAGATTGATGTGTTTTGCTCCTGA146GTGGTCCATTGGATGGTTTGGCTGTTTA151PGGCTGTTTCTCCACCTTCTGTTN181VGTTCCAACTACTGTTTTGTACTCTGCTG226RTTGATCATGCTAGATCTTTGACTN264PCTTTGCCAGCTCCAGATTTGACTCCL278MTGCTGCTTTGATGGCTCCAGT180CCGTTCCAACTTGTAATTTGTACTCTGCTA240CGTTGGTAGATCTTGTTTGAGATCTAC注：标注下划线的碱基为突变位点，用于定点突变的引物的正反向完全互补。图2-1GS115-calb菌株构建流程图Fig.2-1TheflowdiagramofconstructingGS115-calbstrain2.2.4更换信号肽菌株毕赤酵母GS115-calb-N的构建为提高CALB的表达量，将质粒pPICZαA-calb上的α-因子信号肽更换成CALB在南极假丝酵母中的原有的信号肽，采用重叠延伸技术构建质粒pPICZαA-calb-N。构建流程如图2-2所示。

第二章实验材料与方法15图2-2重组质粒pPICZαA-calb-N构建流程图Fig.2-2TheflowdiagramofconstructingrecombinantplasmidofpPICZαA-calb-N根据CALB及其自身信号肽的序列[82]，引物设计如表2.5所示。采用重叠延伸将信号肽添加到基因calb中，获得基因calb-N。随后采用BstBI、NotI对载体pPICZαA和基因calb-N进行双酶切，在T4ligationenzyme作用下连接片段pPICZαA和calb-N，将连接产物转化至E.coliJM109，余下具体步骤参照方法2.2.3，完成表达菌株GS115-calb-N的构建。表2.5构建pPICZαA-calb-N质粒的引物表Table2.5ListofprimersforconstructingplasmidofpPICZαA-calb-N引物名称序列(5’→3’)SP-1AATTGAATTCTCTCTTAACCAATGGAGTAGCAGCAACACAAGTAGCCAAAACACCAGCAACACCSP-2GCCAAAACACCAGCAACACCAGTCAAAGACAACAACTTCATCGTTTCGAATSP-3AGACAACAACTTCATCGTTTCGAATAATTAGTTGTTTTTTGATCTTCTC2.2.5双启动子菌株的构建本实验室保藏的质粒pGAP-EGFP是以GAP为启动子表达绿色荧光蛋白EGFP的重组质粒，将其中的EGFP基因替换成calb基因，即构建得到重组质粒pGAP-calb。具体操作流程如图2-3。根据质粒pGAP-EGFP和基因calb的序列，设计具有同源臂的引物，具体引物设计见表2.6。PCR扩增得到末端互补配对的载体pGAP和基因calb，PCR产物回收纯化后，采用一步克隆试剂盒ClonExpressMultiSOneStepCloningKit连接目的片段和载体，构建得重组质粒pGAP-calb。为构建同时含有组成型启动子GAP和诱导型启动子AOX的双启动子菌株，将前期构建的含AOX启动子的菌株GS115-calb制备成感受态细胞。将含GAP启动子的重组质粒pGAP-calb采用限制性内切酶AvrII线性化后，电转化导入GS115-calb感受态细

【参考文献】：
期刊论文
[1]应用双启动子共表达体系提高人胰岛素原在毕赤酵母中的表达量[J]. 李红亮,陈勇,陈海容,黄程,冯一建,梅翔,何跃,范开.  中国生物制品学杂志. 2012(04)

博士论文
[1]介孔氧化硅固定化脂肪酶及其非水相催化应用[D]. 靳文斌.江南大学 2019
[2]计算机辅助分子设计提高蛋白质热稳定性的研究[D]. 田健.中国农业科学院 2011



本文编号：3574659