转运系统集成改造提升大肠杆菌胞外蛋氨酸积累

发布时间：2022-01-16 11:50

　　通过构建大肠杆菌（Escherichia coli）W3110 MetD吸收系统编码基因metI、metN、metQ单个缺损菌株,获得胞外蛋氨酸吸收速率最小菌株;游离及染色体整合表达YjeH和YeaS分泌系统编码基因yjeH和yeaS,研究增强蛋氨酸分泌与弱化蛋氨酸吸收集成改造策略对菌体胞外蛋氨酸积累和生物量的影响,为理性构建蛋氨酸高产菌株提供可行策略。实验结果表明,基因metI的缺损对胞外蛋氨酸的吸收影响最大,吸收速率降低了16.7%;游离表达基因yjeH和yeaS,胞外蛋氨酸开始积累,胞外蛋氨酸最大积累量为0.21 g/L和0.18 g/L;染色体整合表达基因yjeH和yeaS,胞外蛋氨酸的最大积累量为0.48 g/L和0.25 g/L,与游离表达相比提高了128%和38.9%。增强蛋氨酸分泌与弱化蛋氨酸吸收集成改造策略对于促进胞外蛋氨酸的积累效果显著,可以作为理性构建蛋氨酸高产菌株的策略。 

【文章来源】：食品与生物技术学报. 2020,39(03)北大核心CSCD

【文章页数】：9 页

【部分图文】：

蛋氨酸分析培养基中重组菌株生长状况

利用RT-qPCR比较了菌株M15相对于野生E.coli W3110 yjeH和yeaS基因的表达比率，结果如图7所示，与原始菌株相比，yjeH、yeaS基因的表达水平分别提高了1.65倍和1.59倍。对M15(pET-ABY）和M16(pET-ABY）进行了发酵实验验证基因yjeH、yeaS整合表达对蛋氨酸胞外分泌的影响，如图8所示，M15(pET-ABY）和M16(pET-ABY）最大胞外蛋氨酸的积累量分别为0.48 g/L和0.25 g/L，蛋氨酸产率分别为0.13 g/g DCW和0.08 g/g DCW。与游离表达相比，其产量分别提高了128%和38.9%，产率提高了85.7%和60%。图7 不同菌株yjeH转录水平测定

将实验室前期构建的yjeH、yeaS基因过表达载体p KK-yjeH、p KK-yea S转染M12，记录菌体生长以及胞外蛋氨酸积累情况。从图3可以看出yjeH与yeaS的过表达在一定程度上均抑制了菌体的生长，本研究室前期构建用来表达解除了反馈抑制的高丝氨酸转琥珀酰基酶和增强蛋氨酸代谢过程中的γ-胱硫醚聚合酶以及β-胱硫醚酶[12]的质粒pET-ABY的表达可以有效缓解生长抑制。yjeH、yeaS的过量表达可能使大肠杆菌胞内蛋氨酸质量浓度过低，影响了大肠杆菌生长过程中所需要物质的合成，菌体的生长受到抑制，同时胞外蛋氨酸的质量浓度过高也会抑制菌体的生长，质粒pET-ABY的表达强化了蛋氨酸合成途径，在基因交互作用的影响下其生长抑制得到了有效缓解。对比M12(pET-ABY）、M12(pET-ABY/pKK-yjeH）和M12(pET-ABY/pKK-yeaS）发酵过程中胞内蛋氨酸的质量浓度变化，如图4所示，YjeH、YeaS运输系统的强化促进了大肠杆菌向胞外分泌L-蛋氨酸，降低了胞内L-蛋氨酸的积累，YjeH运输系统的效果更为显著。我们对2种转运系统游离表达菌株进行了发酵实验，结果如图5所示，YjeH与YeaS运输系统的表达都能够在胞外积累一定量的蛋氨酸，其最大积累量分别为0.21 g/L和0.18 g/L，蛋氨酸产率分别为0.06 g/g DCW和0.05 g/g DCW。2.4 YjeH和YeaS在染色体上的整合表达

【参考文献】：
期刊论文
[1]大肠杆菌MetD运输系统缺失对蛋氨酸积累的影响[J]. 李华,董伟,李由然,张梁,丁重阳,石贵阳.  微生物学通报. 2017(06)
[2]大肠杆菌TdcC、SstT和LIV-1系统缺失对胞外L-苏氨酸积累的影响[J]. 杨冬美,李华,李由然,张梁,丁重阳,李赢,顾正华,石贵阳.  微生物学通报. 2017(01)
[3]大肠杆菌PTS系统改造及重组菌生长性能测定[J]. 肖梦榕,张梁,刘双平,石贵阳.  生物工程学报. 2014(10)
[4]过量表达蛋氨酸合成途径基因对重组大肠杆菌产蛋氨酸的影响[J]. 屈更思,郭谦,方芳,堵国成,陈坚.  工业微生物. 2013(05)



本文编号：3592604