低pH冲击促进小白链霉菌高效积累ε-聚赖氨酸的生理机制研究

发布时间：2022-12-10 08:07

　　ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine,简写ε-PL）是由25-35个L-赖氨酸通过α-羧基和ε-氨基缩合而成的一种同型氨基酸聚合物,主要由链霉菌属微生物经好氧发酵产生并在胞外积累。由于ε-PL具有广谱的抑菌活性和较高的食品安全性,目前被用作一种新型生物食品防腐剂,在日本、韩国、美国和中国的食品工业中获得批准使用。此外,ε-PL作为一种安全且环境友好的生物聚合物,在生物医药领域也有着广泛应用前景。因此,ε-PL是一种具有广泛应用领域和巨大市场价值的新型生物技术产品。论文以一株ε-PL工业生产菌株Streptomyces albulus M-Z18为研究对象,通过建立低pH冲击两阶段发酵策略,显著提高了低p H冲击工艺的ε-PL发酵效率;从生理水平和基因转录水平系统探究了低pH冲击对S.albulus M-Z18产生的影响;同时,通过基因失活、回补和过表达等分子操作,研究了S.albulus M-Z18响应低p H冲击的双组分系统MprAB的生理功能;最后,系统研究了S.albulus M-Z18耐受低pH环境胁迫的生理机制,并发现尿素酶系统在S.albulus M-Z18抵御低p... 

【文章页数】：119 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 概述
        1.1.1 ε-聚赖氨酸的简介
        1.1.2 ε-聚赖氨酸的性质
        1.1.3 ε-聚赖氨酸的应用
    1.2 ε-聚赖氨酸生物合成与pH值的关系
    1.3 环境胁迫
        1.3.1 pH冲击
        1.3.2 pH冲击在微生物发酵中的应用
    1.4 微生物响应pH冲击的研究进展
        1.4.1 微生物在形态方面对pH冲击的响应
        1.4.2 微生物在生理方面对pH冲击的响应
        1.4.3 微生物在信号转导方面对pH冲击的响应
    1.5 微生物耐酸机制研究进展
        1.5.1 胞内pH稳态
        1.5.2 细胞膜的改变
        1.5.3 代谢调控
        1.5.4 保护与大分子修复
    1.6 本论文主要研究内容
        1.6.1 立题依据和研究意义
        1.6.2 本论文主要研究内容
第二章 基于葡萄糖为碳源的低pH冲击工艺优化
    2.1 前言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 菌株
        2.2.2 主要试剂和仪器
        2.2.3 培养基
        2.2.4 培养与发酵方法
        2.2.5 分析方法
        2.2.6 pH冲击后菌体的高产遗传特性研究
        2.2.7 显著性分析
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 以葡萄糖为碳源的低pH冲击策略发酵生产ε-PL
        2.3.2 两阶段低pH冲击发酵条件优化
        2.3.3 低pH冲击种子培养的发酵工艺下补料分批发酵生产ε-PL
        2.3.5 pH冲击后菌体的高产遗传特性考察
    2.4 本章小结
第三章 小白链霉菌在生理水平响应低pH冲击的研究
    3.1 前言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 菌株
        3.2.2 培养基
        3.2.3 培养条件
        3.2.4 主要仪器
        3.2.5 分析方法
        3.2.6 pH冲击后菌体的耐酸能力验证
        3.2.7 Pls酶活测定
        3.2.8 胞内游离氨基酸测定
        3.2.9 细胞呼吸活力测定
        3.2.10 细胞膜脂肪酸成分分析
        3.2.11 蛋白浓度的测定
        3.2.12 统计学分析
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 低pH冲击对小白链霉菌发酵生产ε-PL的影响
        3.3.2 低pH冲击对小白链霉菌耐酸能力的影响
        3.3.3 低pH冲击对小白链霉菌细胞膜脂肪酸成分的影响
        3.3.4 低pH冲击对小白链霉菌ε-PL合成酶酶活的影响
        3.3.5 低pH冲击对小白链霉菌呼吸活力的影响
        3.3.6 低pH冲击对小白链霉菌胞内ATP积累量的影响
        3.3.7 低pH冲击对小白链霉菌胞内L-赖氨酸积累的影响
        3.3.8 低pH冲击对小白链霉菌细胞内活性氧以及丙二醛的影响
    3.4 本章小结
第四章 小白链霉菌在转录水平响应低pH冲击的研究
    4.1 前言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 菌株
        4.2.2 培养基
        4.2.3 培养条件
        4.2.4 RNA-Seq样品制备
        4.2.5 转录组测序实验步骤
        4.2.6 转录组信息分析流程
        4.2.7 基因差异表达筛选
        4.2.8 差异表达基因(DEGs)Gene Ontology(GO)富集分析以及KEGG富集分析
        4.2.9 总RNA提取质量
        4.2.10 RNA-seq质量评估
        4.2.11 q RT-PCR
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 差异表达基因的整体分析
        4.3.2 显著差异表达基因的功能分类分析
        4.3.3 显著差异表达基因的代谢途径富集分类分析
        4.3.4 关键显著差异基因的q RT-PCR分析
    4.4 本章小结
第五章 小白链霉菌响应低pH冲击的信号转导途径研究
    5.1 前言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 菌株和质粒
        5.2.2 主要试剂和仪器
        5.2.3 培养基
        5.2.4 培养条件
        5.2.5 质粒构建
        5.2.6 大肠杆菌相关基因克隆实验技术
        5.2.7 链霉菌遗传操作实验技术
        5.2.8 摇瓶发酵参数测定
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 信号转导系统相关显著差异基因的分析
        5.3.2 信号转导系统相关基因的插入失活菌株构建与发酵结果分析
        5.3.3 回补菌株构建与发酵结果分析
        5.3.4 过表达菌株的构建及发酵实验
        5.3.5 mpr A、mpr B和 pep D之间调控关系
    5.4 本章小结
第六章 小白链霉菌耐受低pH的生理机制研究
    6.1 前言
    6.2 材料与方法
        6.2.1 菌株和质粒
        6.2.2 主要试剂和仪器
        6.2.3 培养基
        6.2.4 培养条件
        6.2.5 生理参数测定
        6.2.6 质粒的构建
        6.2.7 大肠杆菌相关基因克隆实验技术
        6.2.8 链霉菌遗传操作实验技术
        6.2.9 突变株耐酸能力验证
        6.2.10 摇瓶以及分批发酵参数测定
    6.3 结果与讨论
        6.3.1 S.albulus M-Z18 耐受低p H值的范围
        6.3.2 S.albulus M-Z18 在胞内微环境水平响应低p H胁迫
        6.3.3 S.albulus M-Z18 在基因转录水平响应低p H胁迫
        6.3.4 维持S.albulus M-Z18 胞内p H稳态的系统鉴定
    6.4 本章小结
主要结论与展望
    主要结论
    展望
论文主要创新点
致谢
参考文献
附录一 :作者在攻读博士学位期间发表的论文
附录二 :qRT-PCR中相关基因序列


【参考文献】：
期刊论文
[1]武夷菌素产生菌CK-15遗传操作系统的优化[J]. 刘艳,葛蓓孛,刘炳花,赵文珺,张克诚.  中国生物防治学报. 2016(04)
[2]基于pH调节和有机氮源流加调控补料分批发酵过程提高ε-聚赖氨酸产量[J]. 孙启星,陈旭升,任喜东,郑根成,毛忠贵.  生物工程学报. 2015(05)
[3]碳源和氮源流加方式对ε-聚赖氨酸补料-分批发酵过程的影响[J]. 陈旭升,董难,毛忠贵.  食品与发酵工业. 2013(08)
[4]一个硫链丝菌素抗性基因标记、用于DNA导入链霉菌的pSET152衍生载体（英文）[J]. 邓名荣,郭俊,冯广达,朱红惠.  微生物学通报. 2013(07)
[5]磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的敲除对于谷氨酸棒杆菌V1生理代谢的影响[J]. 仇爱梅,窦文芳,李会,许正宏.  微生物学通报. 2012(09)
[6]一种简便的ε-聚赖氨酸产生菌的筛选方法[J]. 张超,张东荣,贺魏,段作营,毛忠贵.  山东大学学报(医学版). 2006(11)

博士论文
[1]小白链霉菌同步代谢葡萄糖和甘油合成ε-聚赖氨酸的生理机制研究[D]. 曾昕.江南大学 2016
[2]小白链霉菌响应酸性pH高产ε-聚赖氨酸的生理解析[D]. 任喜东.江南大学 2015
[3]光滑球拟酵母中ATP的生理功能与作用机制[D]. 周景文.江南大学 2009

硕士论文
[1]小白链霉菌响应低pH胁迫生理机制的初步解析[D]. 王开方.江南大学 2019
[2]利迪链霉菌A02高产纳他霉素工程菌的选育[D]. 刘慧.河南师范大学 2014
[3]海洋链霉菌遗传转化系统及次级代谢产物的基因筛选[D]. 黄忠瑶.南京农业大学 2014
[4]吸水链霉菌5008双组分信号转导系统的初步研究[D]. 徐西兵.山东大学 2012



本文编号：3716393