小鼠DDX18对IFN-β产生和病毒增殖的影响
发布时间：2022-12-18 09:55
DEAD-box家族蛋白是一类数量众多、结构高度保守的RNA解旋酶,参与多种生物学过程。近年来,大量的研究发现,DEAD-box RNA解旋酶还参与天然免疫调控,尤其在调控干扰素（Interferon,IFN）产生方面发挥重要作用,但不同的DEAD-box RNA解旋酶对IFN的产生及其下游信号通路的调控作用不同。本实验室前期研究发现猪源DDX18（p DDX18）和人源DDX18（h DDX18）与转录因子IRF3相互作用并抑制IRF3介导的IFN-β启动子激活,从而抑制IFN-β产生,从细胞水平证实DDX18具有调控干扰素的功能。为了从机体水平进一步证实DDX18对干扰素的调控作用,本研究首次在鼠源细胞上验证了鼠源DDX18（mDDX18）负调控IFN-β产生,并在DDX18+/-小鼠体内评价了mDDX18敲低对病毒感染诱导IFN及IFN刺激基因（ISG）表达和对HSV-1及VSV增殖的影响。主要研究内容与结果如下:1. 干扰mDDX18促进病毒诱导的IFN-β产生采用特异性si RNA干扰鼠巨噬细胞RAW264.7内源性DDX18的表达,分析干扰mDDX18...
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表(Abbreviation)
第1章 文献综述
1.1 DExD/H-box家族蛋白概述
1.2 DEAD-box家族蛋白参与天然免疫调控
1.2.1 DEAD-box家族蛋白正调控天然免疫
1.2.2 DEAD-box家族蛋白负调控天然免疫
1.3 DEAD-box家族蛋白影响病毒的增殖
1.3.1 DDX1、DDX3与DDX5 影响病毒的增殖
1.3.2 其它DEAD-box蛋白影响病毒的增殖
1.4 基因敲除小鼠在DEAD-box家族蛋白研究中的应用
1.4.1 基于基因编辑技术的基因敲除小鼠模型构建
1.4.2 DEAD-box家族蛋白基因敲除小鼠的构建与应用
第2章 研究目的与意义
第3章 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 细胞、毒株、菌株与动物
3.1.2 载体与质粒
3.1.3 工具酶、试剂盒、血清和主要化学试剂
3.1.4 Western blot实验材料
3.1.5 培养基和抗生素的配制
3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制
3.1.7 主要实验仪器及设备
3.1.8 动物实验所需的材料和试剂
3.1.9 分子生物学及序列分析软件
3.2 实验方法
3.2.1 细胞及动物组织总RNA的提取
3.2.2 cDNA的合成及目的片段扩增
3.2.3 限制性内切酶酶切反应
3.2.4 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3.2.5 PCR产物或酶切产物的回收与纯化
3.2.6 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
3.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
3.2.8 连接产物的转化
3.2.9 重组质粒的制备
3.2.10 质粒的转染
3.2.11 慢病毒的包装与检测
3.2.12 Real-time PCR
3.2.13 Western blot
3.2.14 siRNA干扰实验
3.2.15 基因敲除小鼠的生产、繁育和检测
3.2.16 HSV-1、VSV及 VSV-GFP病毒的增殖
3.2.17 病毒滴度的测定
3.2.18 小鼠攻毒实验与样品处理
3.2.19 MPM细胞的分离
3.2.20 鼠源IFN-βELISA检测
3.2.21 统计学方法
第4章 结果与分析
4.1 干扰mDDX18 促进病毒诱导的IFN-β产生
4.1.1 siRNA干扰效果检测
4.1.2 干扰mDDX18 促进病毒诱导的IFN-β产生
4.2 mDDX18 抑制IFN-β产生不依赖其ATP酶和解旋酶活性
4.2.1 mDDX18 ATP酶和解旋酶活性突变位点的确定
4.2.2 mDDX18及其酶活突变体质粒的构建
4.2.3 mDDX18及其酶活突变体重组慢病毒的包装与表达
4.2.4 mDDX18 抑制IFN-β产生不依赖其ATP酶和解旋酶活性
4.3 mDDX18基因敲除小鼠的鉴定与繁育
4.4 敲低小鼠DDX18 促进病毒诱导的IFN-β产生
4.4.1 MPM细胞的分离与鉴定
4.4.2 敲低小鼠DDX18 促进病毒诱导的IFN-β产生
4.5 敲低小鼠DDX18对HSV-1 诱导的天然免疫反应和病毒增殖的影响
4.5.1 敲低小鼠DDX18 促进HSV-1 诱导的IFN-β产生
4.5.2 敲低小鼠DDX18 抑制HSV-1 的增殖
4.6 敲低小鼠DDX18对VSV诱导的天然免疫反应和病毒增殖的影响
4.6.1 敲低小鼠DDX18 促进VSV诱导的IFN-β产生
4.6.2 敲低小鼠DDX18 抑制VSV的增殖
第5章 讨论与结论
5.1 讨论
5.1.1 小鼠DDX18对IFN-β产生的影响
5.1.2 小鼠DDX18对病毒增殖的影响
5.1.3 DDX18调控天然免疫的机制探讨
5.2 结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]Understanding the interaction of hepatitis C virus with host DEAD-box RNA helicases[J]. Megha Haridas Upadya,Jude Juventus Aweya,Yee-Joo Tan. World Journal of Gastroenterology. 2014(11)
硕士论文
[1]DDX18负调控IFN-β产生的机制研究[D]. 王墨涵.华中农业大学 2019
本文编号：3721844
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表(Abbreviation)
第1章 文献综述
1.1 DExD/H-box家族蛋白概述
1.2 DEAD-box家族蛋白参与天然免疫调控
1.2.1 DEAD-box家族蛋白正调控天然免疫
1.2.2 DEAD-box家族蛋白负调控天然免疫
1.3 DEAD-box家族蛋白影响病毒的增殖
1.3.1 DDX1、DDX3与DDX5 影响病毒的增殖
1.3.2 其它DEAD-box蛋白影响病毒的增殖
1.4 基因敲除小鼠在DEAD-box家族蛋白研究中的应用
1.4.1 基于基因编辑技术的基因敲除小鼠模型构建
1.4.2 DEAD-box家族蛋白基因敲除小鼠的构建与应用
第2章 研究目的与意义
第3章 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 细胞、毒株、菌株与动物
3.1.2 载体与质粒
3.1.3 工具酶、试剂盒、血清和主要化学试剂
3.1.4 Western blot实验材料
3.1.5 培养基和抗生素的配制
3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制
3.1.7 主要实验仪器及设备
3.1.8 动物实验所需的材料和试剂
3.1.9 分子生物学及序列分析软件
3.2 实验方法
3.2.1 细胞及动物组织总RNA的提取
3.2.2 cDNA的合成及目的片段扩增
3.2.3 限制性内切酶酶切反应
3.2.4 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3.2.5 PCR产物或酶切产物的回收与纯化
3.2.6 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
3.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
3.2.8 连接产物的转化
3.2.9 重组质粒的制备
3.2.10 质粒的转染
3.2.11 慢病毒的包装与检测
3.2.12 Real-time PCR
3.2.13 Western blot
3.2.14 siRNA干扰实验
3.2.15 基因敲除小鼠的生产、繁育和检测
3.2.16 HSV-1、VSV及 VSV-GFP病毒的增殖
3.2.17 病毒滴度的测定
3.2.18 小鼠攻毒实验与样品处理
3.2.19 MPM细胞的分离
3.2.20 鼠源IFN-βELISA检测
3.2.21 统计学方法
第4章 结果与分析
4.1 干扰mDDX18 促进病毒诱导的IFN-β产生
4.1.1 siRNA干扰效果检测
4.1.2 干扰mDDX18 促进病毒诱导的IFN-β产生
4.2 mDDX18 抑制IFN-β产生不依赖其ATP酶和解旋酶活性
4.2.1 mDDX18 ATP酶和解旋酶活性突变位点的确定
4.2.2 mDDX18及其酶活突变体质粒的构建
4.2.3 mDDX18及其酶活突变体重组慢病毒的包装与表达
4.2.4 mDDX18 抑制IFN-β产生不依赖其ATP酶和解旋酶活性
4.3 mDDX18基因敲除小鼠的鉴定与繁育
4.4 敲低小鼠DDX18 促进病毒诱导的IFN-β产生
4.4.1 MPM细胞的分离与鉴定
4.4.2 敲低小鼠DDX18 促进病毒诱导的IFN-β产生
4.5 敲低小鼠DDX18对HSV-1 诱导的天然免疫反应和病毒增殖的影响
4.5.1 敲低小鼠DDX18 促进HSV-1 诱导的IFN-β产生
4.5.2 敲低小鼠DDX18 抑制HSV-1 的增殖
4.6 敲低小鼠DDX18对VSV诱导的天然免疫反应和病毒增殖的影响
4.6.1 敲低小鼠DDX18 促进VSV诱导的IFN-β产生
4.6.2 敲低小鼠DDX18 抑制VSV的增殖
第5章 讨论与结论
5.1 讨论
5.1.1 小鼠DDX18对IFN-β产生的影响
5.1.2 小鼠DDX18对病毒增殖的影响
5.1.3 DDX18调控天然免疫的机制探讨
5.2 结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]Understanding the interaction of hepatitis C virus with host DEAD-box RNA helicases[J]. Megha Haridas Upadya,Jude Juventus Aweya,Yee-Joo Tan. World Journal of Gastroenterology. 2014(11)
硕士论文
[1]DDX18负调控IFN-β产生的机制研究[D]. 王墨涵.华中农业大学 2019
本文编号：3721844
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3721844.html
