委内瑞拉链霉菌中保守调控因子MtrA对生长发育的调控研究
发布时间：2022-12-25 16:08
MtrA是放线菌中一个非常重要的保守调控因子。MtrA是结核分枝杆菌和谷氨酸棒状杆菌细胞生存所必需的调控因子。结核分枝杆菌中MtrAMTB通过与oriC相互作用调节细胞增殖。而谷氨酸棒状杆菌中MtrACGL的作用表现在维持细胞形态、抗生素的耐药性和维持细胞渗透压;它的靶基因具有多种功能,例如可以编码推定的细胞壁肽酶、转运蛋白和膜蛋白。本文对委内瑞拉链霉菌中的MtrA功能进行初步研究,旨在探讨该调控蛋白在委内瑞拉链霉菌生命发育周期中起到的作用,以及对链霉菌气生菌丝形成的调控作用。本实验中先构建含有目的基因上下游同源臂的敲除质粒,进行属间接合转移实验,筛选获得调控基因mtrA/sven2756的缺失突变菌株△2756。将委内瑞拉野生型菌株ISP5230与△2756进行表型分析以及生长曲线绘制,观察到突变菌株△2756的生长速度明显变慢,且无法分化产生气生菌丝及孢子。为进一步确认突变菌株△2756的表型变化是由于缺失sven2756,本研究采用整合型载体pMS82,将含有sven2756启动子区域的完整编码序列连接到该载体上,通过接合转移回补突变菌株△2756获得回补菌株C-△2756。对菌...
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 研究背景
1.1 放线菌
1.1.1 放线菌简介
1.1.2 分枝杆菌属
1.1.3 链霉菌属
1.1.4 棒状杆菌属
1.2 放线菌保守调控因子MtrA
1.2.1 细菌生命活动的调控
1.2.2 结核分枝杆菌中MtrA的调控功能研究
1.2.3 链霉菌中MtrA的调控功能研究
1.2.4 谷氨酸棒状杆菌中MtrA的调控功能研究
1.3 立体依据与研究内容
第二章 实验材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 引物
2.1.3 培养基
2.1.4 抗生素保存和使用浓度
2.2 实验方法
2.2.1 链霉菌的菌种保藏及培养
2.2.2 委内瑞拉链霉菌基因组DNA的提取过程及所用试剂
2.2.3 委内瑞拉链霉菌突变株△2756和回补菌株C-△2756的构建
2.2.3.1 构建突变质粒pMu-SVEN2756
2.2.3.2 属间接合转移获得突变接合子
2.2.3.3 筛选和验证突变株△2756
2.2.3.4 构建、筛选和验证回补菌株C-△2756
2.2.3.5 获得空载回补菌株V-△2756
2.2.4 表型分析试验
2.2.4.1 委内瑞拉链霉菌固体培养表型分析
2.2.4.2 液体培养基中委内瑞拉链霉菌的生长曲线测定
2.2.4.3 扫描电子显微镜（SEM)观察委内瑞拉链霉菌孢子形态
2.2.5 委内瑞拉链霉菌总RNA的提取
2.2.6 ISP5230与△2756的产孢相关基因转录水平差异分析
2.2.7 构建、表达和纯化His-SVEN2756融合蛋白
2.2.7.1 构建表达质粒pET28a-2756
2.2.7.2 诱导表达融合蛋白His-SVEN2756
2.2.7.3 Ni柱法纯化融合蛋白His-SVEN2756
2.2.8 融合蛋白His-SVEN2756 SDS-PAGE电泳检测以及浓度的测定
2.2.9 调控因子与靶基因体外结合实验——凝胶迁移试验(EMSA)
第三章 实验结果与分析
3.1 SVEN2756的序列分析
3.2 sven2756基因缺失突变菌株△2756的构建
3.3 回补菌株C-△2756的构建
3.4 pMS82空载体回补菌株V-△2756的构建
3.5 链霉菌表型分析
3.5.1 ISP5230、△2756、C-△2756和V-△2756的表型观察
3.5.2 ISP5230、△2756和C-△2756菌株生长曲线的测定
3.5.3 扫描电子显微镜观察ISP5230、△2756和C-△2756的表型
3.6 ISP5230与△2756菌株基因的转录水平分析
3.7 获得异源表达的SVEN2756蛋白
3.8 SVEN2756与探针的体外结合试验
第四章 总结与展望
4.1 全文总结
4.2 研究展望
参考文献
致谢
学位论文评阅及答辩情况表
【参考文献】：
期刊论文
[1]放线菌的研究现况与展望[J]. 张超群,戴建荣. 中国病原生物学杂志. 2019(01)
[2]影响凝胶迁移率实验因素的教学改进[J]. 周超,赵翔宇,高新起,郭兴启,苏英华. 实验室科学. 2018(05)
[3]sco1135基因对天蓝色链霉菌M145孢子形成及次级代谢产物合成的调控研究[J]. 马军霞,张佩佩,王世立,曹广祥. 生物技术通报. 2017(01)
博士论文
[1]天蓝色链霉菌中一对新的双组分信号转导系统MacRS调控机制的研究[D]. 刘萌.山东大学 2019
[2]天蓝色链霉菌cslA基因的研究[D]. 徐红斌.华中农业大学 2008
硕士论文
[1]天蓝色链霉菌sco1135调控孢子生长和ACT次级代谢产物生物合成的分子机制研究[D]. 马军霞.济南大学 2017
[2]天蓝色链霉菌双组分信号转导系统SCO2120/SCO2121的功能研究[D]. 于晓秋.山东大学 2015
本文编号：3726934
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 研究背景
1.1 放线菌
1.1.1 放线菌简介
1.1.2 分枝杆菌属
1.1.3 链霉菌属
1.1.4 棒状杆菌属
1.2 放线菌保守调控因子MtrA
1.2.1 细菌生命活动的调控
1.2.2 结核分枝杆菌中MtrA的调控功能研究
1.2.3 链霉菌中MtrA的调控功能研究
1.2.4 谷氨酸棒状杆菌中MtrA的调控功能研究
1.3 立体依据与研究内容
第二章 实验材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 引物
2.1.3 培养基
2.1.4 抗生素保存和使用浓度
2.2 实验方法
2.2.1 链霉菌的菌种保藏及培养
2.2.2 委内瑞拉链霉菌基因组DNA的提取过程及所用试剂
2.2.3 委内瑞拉链霉菌突变株△2756和回补菌株C-△2756的构建
2.2.3.1 构建突变质粒pMu-SVEN2756
2.2.3.2 属间接合转移获得突变接合子
2.2.3.3 筛选和验证突变株△2756
2.2.3.4 构建、筛选和验证回补菌株C-△2756
2.2.3.5 获得空载回补菌株V-△2756
2.2.4 表型分析试验
2.2.4.1 委内瑞拉链霉菌固体培养表型分析
2.2.4.2 液体培养基中委内瑞拉链霉菌的生长曲线测定
2.2.4.3 扫描电子显微镜（SEM)观察委内瑞拉链霉菌孢子形态
2.2.5 委内瑞拉链霉菌总RNA的提取
2.2.6 ISP5230与△2756的产孢相关基因转录水平差异分析
2.2.7 构建、表达和纯化His-SVEN2756融合蛋白
2.2.7.1 构建表达质粒pET28a-2756
2.2.7.2 诱导表达融合蛋白His-SVEN2756
2.2.7.3 Ni柱法纯化融合蛋白His-SVEN2756
2.2.8 融合蛋白His-SVEN2756 SDS-PAGE电泳检测以及浓度的测定
2.2.9 调控因子与靶基因体外结合实验——凝胶迁移试验(EMSA)
第三章 实验结果与分析
3.1 SVEN2756的序列分析
3.2 sven2756基因缺失突变菌株△2756的构建
3.3 回补菌株C-△2756的构建
3.4 pMS82空载体回补菌株V-△2756的构建
3.5 链霉菌表型分析
3.5.1 ISP5230、△2756、C-△2756和V-△2756的表型观察
3.5.2 ISP5230、△2756和C-△2756菌株生长曲线的测定
3.5.3 扫描电子显微镜观察ISP5230、△2756和C-△2756的表型
3.6 ISP5230与△2756菌株基因的转录水平分析
3.7 获得异源表达的SVEN2756蛋白
3.8 SVEN2756与探针的体外结合试验
第四章 总结与展望
4.1 全文总结
4.2 研究展望
参考文献
致谢
学位论文评阅及答辩情况表
【参考文献】：
期刊论文
[1]放线菌的研究现况与展望[J]. 张超群,戴建荣. 中国病原生物学杂志. 2019(01)
[2]影响凝胶迁移率实验因素的教学改进[J]. 周超,赵翔宇,高新起,郭兴启,苏英华. 实验室科学. 2018(05)
[3]sco1135基因对天蓝色链霉菌M145孢子形成及次级代谢产物合成的调控研究[J]. 马军霞,张佩佩,王世立,曹广祥. 生物技术通报. 2017(01)
博士论文
[1]天蓝色链霉菌中一对新的双组分信号转导系统MacRS调控机制的研究[D]. 刘萌.山东大学 2019
[2]天蓝色链霉菌cslA基因的研究[D]. 徐红斌.华中农业大学 2008
硕士论文
[1]天蓝色链霉菌sco1135调控孢子生长和ACT次级代谢产物生物合成的分子机制研究[D]. 马军霞.济南大学 2017
[2]天蓝色链霉菌双组分信号转导系统SCO2120/SCO2121的功能研究[D]. 于晓秋.山东大学 2015
本文编号：3726934
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3726934.html
