双异腈天然产物SF2768生物合成途径及生理功能的研究
发布时间：2023-04-18 19:14
异腈是一类同时具有亲核和亲电性质的特殊化学基团,含有异腈基团的天然产物一般都具有生物活性。从第一例异腈天然产物被发现到2016年的70年间,总共只有约200个异腈天然产物被分离鉴定,而其中双异腈化合物的数量更是非常少。经不完全统计,到2020年2月为止只有不超过10个双异腈天然产物的母核被报道。由于这些化合物具有如抑菌、金属螯合、抗疟和细胞毒性等生物活性,对它们的生物合成及作用机制进行研究在理解微生物的行为、微生物与环境互作和药物设计等方面是具有积极的意义的。课题组前期从硫藤黄链霉菌中成功克隆到一个双异腈天然产物SF2768的生物合成基因簇,通过分子生物学和天然产物结构鉴定等手段推测了其生物合成途径,同时证明了SF2768能特异性结合铜离子并以复合物的形式进入细胞。本文基于前期工作,对SF2768生物合成途径中的酶进行了系统的研究。通过体外重建生物合成途径,我们成功地利用四个生物合成酶Sfa B,Sfa C,Sfa D和Sfa E在体外合成了具有异戊酰基侧链的SF2768类似物,确定了SF2768骨架的合成机制;同时通过化学衍生化捕获了反应途径中的醛中间体,确认了所推测的合成途径的正确...
【文章页数】：163 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语
第一章 前言
1.1 双异腈类天然产物研究进展
1.1.1 Xanthocillin相关研究进展
1.1.2 Hazimycin相关研究进展
1.1.3 双异腈萜类相关报道
1.1.4 双异腈多元醇衍生物研究进展
1.1.5 异腈脂肽研究进展
1.2 异腈类天然产物合成与降解机制的研究进展
1.2.1 异腈天然产物生物合成研究进展
1.2.2 异腈生物降解的第一步—水合
1.2.3 异腈生物降解的第二步—酰胺水解
1.3 本研究的目的和意义
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 引物序列
2.1.3 生化试剂
2.1.4 仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 常规微生物学和分子生物学操作
2.2.2 化合物的发酵检测和分离纯化
2.2.3 Sfa B-Sfa E的体外反应
2.2.4 SfaB的酶学实验
2.2.5 SfaF的体外和点突变实验
2.2.6 铬天青显色实验
2.2.7 SF2768酸水解实验
2.2.8 SfaD底物偏好性实验
2.2.9 SF2768-Cu复合物生物活性测定
2.2.10 ICP-MS检测铜离子丰度实验
2.2.11 胞内ATP丰度检测
2.2.12 活性氧检测实验
2.2.13 酪氨酸酶抑制实验
第三章 通过体外重建揭示SF2768的生物合成途径
3.1 前言
3.2 结果与分析
3.2.1 SF2768非异腈类似物的分离与鉴定
3.2.2 SF2768非异腈类似物的体外合成
3.2.3 反应体系中醛中间体的捕捉
3.2.4 基于腺苷化酶底物宽泛性的天然产物多样化
3.2.5 对异腈基团生物合成的探索
3.3 讨论
第四章 SF2768的自抗性及降解途径的研究
4.1 前言
4.2 结果与分析
4.2.1 发酵液中水合类似物的分离鉴定
4.2.2 异腈水合酶SfaF的发现
4.2.3 异腈水合酶Sfa F体外对SF2768 活性的影响
4.2.4 异腈水合酶SfaF体外产物的分离鉴定
4.2.5 异腈水合酶SfaF活性位点及动力学分析
4.2.6 SF2768及其水合产物结合铜离子的能力的测定
4.3 讨论
第五章 SF2768通过活性氧来发挥抑菌作用
5.1 前言
5.2 结果与分析
5.2.1 SF2768类似物的分离与结对构型的鉴定
5.2.2 SF2768的抑菌活性可被铜离子消除
5.2.3 SF2768抑菌机理的推测
5.2.4 SF2768功能的总结
5.3 讨论
第六章 总结与展望
6.1 总结
6.2 展望
参考文献
博士期间发表文章
致谢
附录
第三章 附录
第四章 附录
第五章 附录
本文编号：3792859
【文章页数】：163 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语
第一章 前言
1.1 双异腈类天然产物研究进展
1.1.1 Xanthocillin相关研究进展
1.1.2 Hazimycin相关研究进展
1.1.3 双异腈萜类相关报道
1.1.4 双异腈多元醇衍生物研究进展
1.1.5 异腈脂肽研究进展
1.2 异腈类天然产物合成与降解机制的研究进展
1.2.1 异腈天然产物生物合成研究进展
1.2.2 异腈生物降解的第一步—水合
1.2.3 异腈生物降解的第二步—酰胺水解
1.3 本研究的目的和意义
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 引物序列
2.1.3 生化试剂
2.1.4 仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 常规微生物学和分子生物学操作
2.2.2 化合物的发酵检测和分离纯化
2.2.3 Sfa B-Sfa E的体外反应
2.2.4 SfaB的酶学实验
2.2.5 SfaF的体外和点突变实验
2.2.6 铬天青显色实验
2.2.7 SF2768酸水解实验
2.2.8 SfaD底物偏好性实验
2.2.9 SF2768-Cu复合物生物活性测定
2.2.10 ICP-MS检测铜离子丰度实验
2.2.11 胞内ATP丰度检测
2.2.12 活性氧检测实验
2.2.13 酪氨酸酶抑制实验
第三章 通过体外重建揭示SF2768的生物合成途径
3.1 前言
3.2 结果与分析
3.2.1 SF2768非异腈类似物的分离与鉴定
3.2.2 SF2768非异腈类似物的体外合成
3.2.3 反应体系中醛中间体的捕捉
3.2.4 基于腺苷化酶底物宽泛性的天然产物多样化
3.2.5 对异腈基团生物合成的探索
3.3 讨论
第四章 SF2768的自抗性及降解途径的研究
4.1 前言
4.2 结果与分析
4.2.1 发酵液中水合类似物的分离鉴定
4.2.2 异腈水合酶SfaF的发现
4.2.3 异腈水合酶Sfa F体外对SF2768 活性的影响
4.2.4 异腈水合酶SfaF体外产物的分离鉴定
4.2.5 异腈水合酶SfaF活性位点及动力学分析
4.2.6 SF2768及其水合产物结合铜离子的能力的测定
4.3 讨论
第五章 SF2768通过活性氧来发挥抑菌作用
5.1 前言
5.2 结果与分析
5.2.1 SF2768类似物的分离与结对构型的鉴定
5.2.2 SF2768的抑菌活性可被铜离子消除
5.2.3 SF2768抑菌机理的推测
5.2.4 SF2768功能的总结
5.3 讨论
第六章 总结与展望
6.1 总结
6.2 展望
参考文献
博士期间发表文章
致谢
附录
第三章 附录
第四章 附录
第五章 附录
本文编号：3792859
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