基于亲和纯化的无损伤式小细胞外囊泡分离方法的建立及应用

发布时间：2023-04-23 13:18

　　小细胞外囊泡(Small extracellular vesicles,sEVs)是大多数细胞分泌的具有脂质双分子层结构的纳米级囊泡,在细胞与细胞之间的通讯中起着重要的作用。然而,由于其粒径小、丰度小和密度低,目前存在的提取小细胞外囊泡的方法都存在或多或少不同的缺陷,小细胞外囊泡的有效分离和无损释放仍然面临巨大挑战。针对目前小细胞外囊泡分离和纯化过程中存在的问题,我们设计了两种基于Annexin V的亲和磁珠,一种是使用FITC作为中间体,将Annexin V-FITC固定于抗FITC抗体磁珠上;另一种为直接将Annexin V偶联在羧基磁珠上。这两种磁珠分离和纯化小细胞外囊泡的原理相同,均为利用磁珠表面的Annexin V以钙离子依赖的方式与小细胞外囊泡表面的磷酯酰丝氨酸结合,从而富集磷酯酰丝氨酸阳性的小细胞外囊泡。经磁分离后,可去除小细胞外囊泡以外的其他杂质,更重要的是,通过添加含有金属离子螯合剂EDTA的洗脱液,磁珠富集的小细胞外囊泡可被无损伤释放和分离。将此方法应用于从胃癌细胞MGC-803的培养上清液中分离和纯化小细胞外囊泡,经过NTA,TEM以及Western blot检测...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
符号说明
1 前言
    1.1 小细胞外囊泡
        1.1.1 小细胞外囊泡的形成、结构及功能
        1.1.2 小细胞外囊泡在临床诊断及治疗中的应用
    1.2 小细胞外囊泡分离方法概述
        1.2.1 超速离心法
        1.2.2 密度梯度离心法
        1.2.3 尺寸色谱排阻法
        1.2.4 沉淀法
        1.2.5 免疫磁珠法
    1.3 磷酯酰丝氨酸
    1.4 研究目的与研究策略
2 Annexin V-FITC亲和磁珠的构建
    2.1 Annexin V表达纯化
        2.1.1 实验原理
        2.1.2 实验仪器与设备
        2.1.3 实验材料
        2.1.4 实验溶液配制
        2.1.5 实验方法
        2.1.6 实验结果
    2.2 Annexin V-FITC偶联与纯化
        2.2.1 实验原理
        2.2.2 实验仪器与设备
        2.2.3 实验试剂与材料
        2.2.4 实验溶液配制
        2.2.5 实验方法
        2.2.6 实验结果
    2.3 Annexin V-FITC亲和磁珠的构建
        2.3.1 实验原理
        2.3.2 实验仪器与设备
        2.3.3 实验试剂与材料
        2.3.4 实验方法
        2.3.5 实验结果
    2.4 小结
3 基于Annexin V-FITC亲和磁珠分离和纯化小细胞外囊泡方法的建立及应用
    3.1 小细胞外囊泡的分离、纯化和鉴定
        3.1.1 实验原理
        3.1.2 实验仪器与设备
        3.1.3 实验试剂与材料
        3.1.4 实验溶液配制
        3.1.5 实验方法
        3.1.6 实验结果
    3.2 实验条件优化
        3.2.1 实验溶液配制
        3.2.2 实验方法
        3.2.3 实验结果
    3.3 Annexin V-FITC亲和磁珠法和超速离心法分离的小细胞外囊泡的对比
        3.3.1 实验原理
        3.3.2 实验方法
        3.3.3 实验结果
    3.4 Annexin V-FITC亲和磁珠分离和纯化的小细胞外囊泡生物活性评价
        3.4.1 实验原理
        3.4.2 实验仪器与设备
        3.4.3 实验试剂与材料
        3.4.4 实验方法
        3.4.5 实验结果
    3.5 Annexin V-FITC亲和磁珠分离和纯化小细胞外囊泡的应用
        3.5.1 研究背景
        3.5.2 实验方法
        3.5.3 实验结果
    3.6 小结
4 基于Annexin V亲和磁珠分离和纯化小细胞外囊泡方法的建立及应用
    4.1 Annexin V亲和磁珠的构建
        4.1.1 实验原理
        4.1.2 实验仪器与设备
        4.1.3 实验试剂与材料
        4.1.4 实验溶液配制
        4.1.5 实验方法
        4.1.6 Annexin V-FITC亲和磁珠法和Annexin V亲和磁珠分离法分离的小细胞外囊泡的对比
        4.1.7 实验结果
    4.2 小结
5 总结与展望
参考文献
在学期间发表的学术论文与研究成果
致谢



本文编号：3799798