基于亚磷酸盐/细菌碱性磷酸酶的植物遗传转化体系的建立
发布时间：2023-05-10 06:11
植物进行遗传转化时,选择标记是不可或缺的重要一环。目前,植物转化常用的选择标记主要有两大类——抗生素抗性基因和抗除草剂基因,但现在由它们引起的生物安全性担忧正日趋严重,所以开发一种新型且安全的选择标记越来越被重视。亚磷酸盐脱氢酶(phosphite dehydrogenase,PTDH)是一种依赖于NAD+、将亚磷酸盐(Phi)氧化为正磷酸盐(Pi)的酶。Phi不能被植物直接利用,相反对植物具有毒害作用。基于此特性,目前利用Phi/PTDH组合已建立起一套新型多用途且有广泛应用前景的植物转化显性选择标记/植物磷利用/杂草控制系统。为了打破这套技术系统的国际专利壁垒,其关键点就是鉴定出PTDH的功能替代。由于大肠杆菌碱性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase,BAP)也具有将Phi氧化为Pi的活性且无辅酶依赖性,因此本工作试图通过将它的基因EcBAP(即phoA)转入植物中并以Phi作为选择剂,验证它能否顶替PTDH从而建立起Phi/BAP基础上的类似系统。取得的主要结果如下:(1)EcBAP的基因克隆及其表达载体的构建首先从大肠杆菌D...
【文章页数】：92 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第1章 引言
1.1 文献综述
1.1.1 目前植物遗传转化选择标记概述
1.1.2 基于亚磷酸盐/亚磷酸盐脱氢酶的遗传转化和抗除草剂系统
1.1.2.1 当前植物利用磷的主要问题
1.1.2.2 亚磷酸盐的特性
1.1.2.3 亚磷酸盐脱氢酶的生物学特性
1.1.2.4 亚磷酸盐脱氢酶的应用
1.2 本论文的研究目的及意义
第2章 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 实验材料
2.1.2 试剂和工具酶
2.1.2.1 试剂
2.1.2.2 工具酶
2.1.3 实验所用试剂的配置
2.1.4 实验所用引物
2.2 实验方法
2.2.1 植物表达载体的构建
2.2.1.1 Escherichia coli基因组DNA的提取
2.2.1.2 核酸琼脂糖凝胶电泳
2.2.1.3 EcBAP基因的扩增
2.2.1.4 植物载体的构建
2.2.1.5 菌落PCR鉴定阳性克隆
2.2.1.6 重组质粒的提取和测序
2.2.2 转基因烟草的转化及培养
2.2.2.1 农杆菌(LBA4404)感受态的制备
2.2.2.2 阳性质粒转农杆菌(LBA4404)及菌落阳性鉴定
2.2.2.3 阳性质粒转农杆菌(LBA4404)烟草转化及培养
2.2.2.4 烟草叶盘转化法及转基因烟草的无菌培养
2.2.2.5 EcBAP转基因烟草阳性植株的鉴定
2.2.2.6 EcBAP转基因烟草阳性植株RT-PCR
2.2.2.7 EcBAP阳性转基因烟草Phi胁迫下的叶片再生
2.2.2.8 EcBAP转基因烟草子代的Phi抗性分析
2.2.3 原核表达载体的构建及蛋白表达酶活分析
2.2.3.1 基因的扩增
2.2.3.2 原核表达载体pET(EcBAP)的构建
2.2.3.3 菌落PCR鉴定阳性克隆
2.2.3.4 重组质粒的提取和测序
2.2.4 蛋白表达及酶活分析
2.2.4.1 表达载体转BL21(DE3)
2.2.4.2 蛋白的诱导表达
2.2.4.3 SDS-PAGE
2.2.4.4 EcBAP蛋白活性胶跑胶
2.2.4.5 分光光度法测蛋白EcBAP酶活
第3章 结果与分析
3.1 pBI(EcBAP)植物表达载体的构建及转化
3.1.1 EcBAP基因的扩增
3.1.2 PCR产物EcBAP、载体pBI121的酶切及连接
3.1.3 pBI(EcBAP)转化农杆菌LBA4404
3.2 基于卡那霉素筛选的农杆菌侵染转化烟草
3.3 卡那霉素抗性pBI(EcBAP)转基因烟草阳性植株的鉴定
3.4 EcBAP(Kan)转基因烟草叶片在含不同浓度Phi的缺PiMS培养基上的再生
3.5 EcBAP(Kan)转基因烟草叶片在含不同浓度Phi的正常MS培养基上的再生
3.6 以Phi作为筛选剂进行农杆菌侵染烟草转化
3.7 Phi抗性Ec BAP转基因烟草植株的鉴定
3.8 2.5mM Phi筛选下EcBAP转基因烟草的基因表达分析
3.9 亚磷酸盐胁迫和杂草控制实验
3.9.1 亚磷酸盐胁迫水平平板实验
3.9.2 亚磷酸盐胁迫垂直平板实验
3.9.3 杂草控制系统实验
3.10 EcBAP基因在大肠杆菌中的重组表达及其酶活分析
3.10.1 原核表达载体pET(EcBAP)的构建
3.10.2 pET(EcBAP)的蛋白表达
3.10.3 重组蛋白EcBAP的纯化及酶活测定
第4章 总结与讨论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文和研究成果
致谢
本文编号：3813198
【文章页数】：92 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第1章 引言
1.1 文献综述
1.1.1 目前植物遗传转化选择标记概述
1.1.2 基于亚磷酸盐/亚磷酸盐脱氢酶的遗传转化和抗除草剂系统
1.1.2.1 当前植物利用磷的主要问题
1.1.2.2 亚磷酸盐的特性
1.1.2.3 亚磷酸盐脱氢酶的生物学特性
1.1.2.4 亚磷酸盐脱氢酶的应用
1.2 本论文的研究目的及意义
第2章 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 实验材料
2.1.2 试剂和工具酶
2.1.2.1 试剂
2.1.2.2 工具酶
2.1.3 实验所用试剂的配置
2.1.4 实验所用引物
2.2 实验方法
2.2.1 植物表达载体的构建
2.2.1.1 Escherichia coli基因组DNA的提取
2.2.1.2 核酸琼脂糖凝胶电泳
2.2.1.3 EcBAP基因的扩增
2.2.1.4 植物载体的构建
2.2.1.5 菌落PCR鉴定阳性克隆
2.2.1.6 重组质粒的提取和测序
2.2.2 转基因烟草的转化及培养
2.2.2.1 农杆菌(LBA4404)感受态的制备
2.2.2.2 阳性质粒转农杆菌(LBA4404)及菌落阳性鉴定
2.2.2.3 阳性质粒转农杆菌(LBA4404)烟草转化及培养
2.2.2.4 烟草叶盘转化法及转基因烟草的无菌培养
2.2.2.5 EcBAP转基因烟草阳性植株的鉴定
2.2.2.6 EcBAP转基因烟草阳性植株RT-PCR
2.2.2.7 EcBAP阳性转基因烟草Phi胁迫下的叶片再生
2.2.2.8 EcBAP转基因烟草子代的Phi抗性分析
2.2.3 原核表达载体的构建及蛋白表达酶活分析
2.2.3.1 基因的扩增
2.2.3.2 原核表达载体pET(EcBAP)的构建
2.2.3.3 菌落PCR鉴定阳性克隆
2.2.3.4 重组质粒的提取和测序
2.2.4 蛋白表达及酶活分析
2.2.4.1 表达载体转BL21(DE3)
2.2.4.2 蛋白的诱导表达
2.2.4.3 SDS-PAGE
2.2.4.4 EcBAP蛋白活性胶跑胶
2.2.4.5 分光光度法测蛋白EcBAP酶活
第3章 结果与分析
3.1 pBI(EcBAP)植物表达载体的构建及转化
3.1.1 EcBAP基因的扩增
3.1.2 PCR产物EcBAP、载体pBI121的酶切及连接
3.1.3 pBI(EcBAP)转化农杆菌LBA4404
3.2 基于卡那霉素筛选的农杆菌侵染转化烟草
3.3 卡那霉素抗性pBI(EcBAP)转基因烟草阳性植株的鉴定
3.4 EcBAP(Kan)转基因烟草叶片在含不同浓度Phi的缺PiMS培养基上的再生
3.5 EcBAP(Kan)转基因烟草叶片在含不同浓度Phi的正常MS培养基上的再生
3.6 以Phi作为筛选剂进行农杆菌侵染烟草转化
3.7 Phi抗性Ec BAP转基因烟草植株的鉴定
3.8 2.5mM Phi筛选下EcBAP转基因烟草的基因表达分析
3.9 亚磷酸盐胁迫和杂草控制实验
3.9.1 亚磷酸盐胁迫水平平板实验
3.9.2 亚磷酸盐胁迫垂直平板实验
3.9.3 杂草控制系统实验
3.10 EcBAP基因在大肠杆菌中的重组表达及其酶活分析
3.10.1 原核表达载体pET(EcBAP)的构建
3.10.2 pET(EcBAP)的蛋白表达
3.10.3 重组蛋白EcBAP的纯化及酶活测定
第4章 总结与讨论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文和研究成果
致谢
本文编号：3813198
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3813198.html
