利用邻近生物素标记技术结合质谱分析鉴定核仁相关蛋白

发布时间：2023-05-13 02:28

　　目的:在小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC)中,基于抗坏血酸过氧化物酶(engineered ascorbate peroxidase,APEX2)的邻近标记技术和质谱鉴定核仁相关蛋白。方法:构建稳定过表达APEX2-FBL细胞系,通过APEX2邻近标记技术获得生物素标记蛋白,用链酶亲和素包裹的磁珠对生物素标记的蛋白进行富集,随后运用液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)鉴定,并对数据进行生物信息学分析,筛选差异蛋白。结果:成功构建稳定高表达APEX2-FBL细胞系;Western blot结果显示,通过APEX2邻近标记技术获得大量生物素标记蛋白;质谱鉴定出837个差异蛋白,且生物学过程多与核仁相关。结论:利用邻近生物素标记技术结合质谱分析是一种可行的鉴定核仁相关蛋白的方法。

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【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 N2B27培养基配置
        1.2.2 小鼠胚胎干细胞的培养
        1.2.3 构建PB-HA-APEX2-FBL过表达载体
        1.2.4 构建FBL过表达细胞系
        1.2.5 细胞爬片的免疫荧光实验
        1.2.6 基于APEX2的邻近生物素标记技术
        1.2.7 Western blot检测蛋白表达水平
        1.2.8 生物素标记蛋白富集与液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析[12]
        1.2.9 构建NCL-RFP基因敲入细胞系
    1.3 生物信息学分析
2 结果
    2.1 构建APEX2-FBL过表达的m ESC稳定细胞系
    2.2 对FBL邻近蛋白进行生物素标记
    2.3 GO分析显示差异蛋白与核仁相关
    2.4 差异蛋白与已发表数据有交叉
    2.5 验证本研究鉴定的相关核仁蛋白
3 讨论



本文编号：3815112