利用两类不同CRISPR：Cas12a和Cas13a对逆转录转座子的干预研究
发布时间：2023-05-13 05:42
近年来,CRISPR已成为对抗外源逆转录病毒病原体和器官移植中灭活内源性逆转录病毒的重要且有前途的工具。CRISPR-Cas系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeat-CRISPR-associated systems)是细菌及古生菌产生和进化的抵御外来遗传物质入侵的适应性免疫系统,通过形成cr RNA(CRISPR RNA)-效应蛋白复合物,识别并破坏特定的外源序列,比如噬菌体病毒和外源DNA,某些情况下为RNA。基于该系统的特性,现已开发出一系列高效的基因编辑工具,被广泛应用于对各宿主基因组进行编辑。CRISPR-Cas12a蛋白,属于CRISPR核酸内切酶家族的2类V型蛋白,缺乏HNH结构域,具有单个Ruv C核酸酶结构域和一个推定的Nuc结构域,分别负责两条DNA链的切割。Cas12a蛋白同时具有DNA和RNA核酸酶活性,可实现对多个基因的同时编辑,常在细菌、植物和哺乳动物细胞中调节异源DNA编辑。2类VI型CRISPR-Cas13效应蛋白,具有特异地靶向和切割单链RNA而不是双链DNA底物的独特能力。...
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 绪论
1.1 CRISPR-Cas系统
1.1.1 CRISPR-Cas系统的作用机制
1.1.2 CRISPR-Cas系统的分类及应用现状
1.2 CRISPR-Cas12a:高效的DNA编辑工具
1.2.1 CRISPR-Cas12a蛋白的作用特点
1.2.2 CRISPR-Cas12a系统的应用研究
1.3 CRISPR-Cas13a:靶向RNA的 CRISPR效应蛋白
1.3.1 CRISPR-Cas13a蛋白的作用特点
1.3.2 CRISPR-Cas13a系统的应用研究
1.4 逆转录转座子与逆转录病毒
1.4.1 逆转录转座子与逆转录病毒的相似性
1.4.2 CRISPR技术抑制/干扰逆转录病毒的研究
1.5 本研究的目的意义及主要内容
2 裂殖酵母中CRISPR-Cas12a基因编辑系统的实施和优化
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 引物、质粒和菌株
2.2.2 试剂和仪器
2.3 实验方法
2.3.1 裂殖酵母的转化培养及生长速率的测定
2.3.2 靶向MEL1 基因的Cas12a系统构建
2.3.3 donor DNA的获取
2.4 实验结果与分析
2.4.1 整合表达Fn Cas12a和 Lb Cas12a蛋白对裂殖酵母影响
2.4.2 在裂殖酵母中实施CRISPR-Cas12a编辑系统
2.4.3 优化裂殖酵母中CRISPR-Cas12a系统
3 利用CRISPR-Cas12a编辑系统干扰裂殖酵母逆转录转座子Tf1 的转座
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 引物,质粒和菌株
3.2.2 试剂和仪器
3.3 实验方法
3.3.1 含有人工内含子的Tf1逆转座报告系统的构建
3.3.2 靶向NEO基因的CRISPR-Cas12a系统构建
3.3.3 裂殖酵母逆转座子Tf1转座效率的测定
3.4 实验结果与分析
3.4.1 构建Tf1转座报告系统,用于裂殖酵母的转座干扰分析
3.4.2 CRISPR-Cas12a干扰Tf1 逆转座且仍有残留的转座活性
3.4.3 通过延长cr RNA靶向作用,CRISPR-Cas12a可完全消除Tf1 转座活性
4 利用CRISPR-Cas13a编辑系统干扰裂殖酵母逆转录转座子Tf1 的转座
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 引物,质粒和菌株
4.2.2 试剂和仪器
4.3 实验方法
4.3.1 靶向Tf1 转录本的CRISPR-Cas13a系统构建
4.3.2 裂殖酵母逆转座子Tf1转座效率的测定
4.4 实验结果与分析
4.4.1 CRISPR-Cas13a靶向Tf1 RNA中间体干扰Tf1 逆转座
4.4.2 Tf1 转录本激活Cas13a不会诱导裂殖酵母细胞生长停滞
5 总结与展望
5.1 全文总结
5.2 展望
参考文献
附录A 基本实验操作
攻读学位期间发表的学术论文目录
致谢
本文编号：3815420
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 绪论
1.1 CRISPR-Cas系统
1.1.1 CRISPR-Cas系统的作用机制
1.1.2 CRISPR-Cas系统的分类及应用现状
1.2 CRISPR-Cas12a:高效的DNA编辑工具
1.2.1 CRISPR-Cas12a蛋白的作用特点
1.2.2 CRISPR-Cas12a系统的应用研究
1.3 CRISPR-Cas13a:靶向RNA的 CRISPR效应蛋白
1.3.1 CRISPR-Cas13a蛋白的作用特点
1.3.2 CRISPR-Cas13a系统的应用研究
1.4 逆转录转座子与逆转录病毒
1.4.1 逆转录转座子与逆转录病毒的相似性
1.4.2 CRISPR技术抑制/干扰逆转录病毒的研究
1.5 本研究的目的意义及主要内容
2 裂殖酵母中CRISPR-Cas12a基因编辑系统的实施和优化
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 引物、质粒和菌株
2.2.2 试剂和仪器
2.3 实验方法
2.3.1 裂殖酵母的转化培养及生长速率的测定
2.3.2 靶向MEL1 基因的Cas12a系统构建
2.3.3 donor DNA的获取
2.4 实验结果与分析
2.4.1 整合表达Fn Cas12a和 Lb Cas12a蛋白对裂殖酵母影响
2.4.2 在裂殖酵母中实施CRISPR-Cas12a编辑系统
2.4.3 优化裂殖酵母中CRISPR-Cas12a系统
3 利用CRISPR-Cas12a编辑系统干扰裂殖酵母逆转录转座子Tf1 的转座
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 引物,质粒和菌株
3.2.2 试剂和仪器
3.3 实验方法
3.3.1 含有人工内含子的Tf1逆转座报告系统的构建
3.3.2 靶向NEO基因的CRISPR-Cas12a系统构建
3.3.3 裂殖酵母逆转座子Tf1转座效率的测定
3.4 实验结果与分析
3.4.1 构建Tf1转座报告系统,用于裂殖酵母的转座干扰分析
3.4.2 CRISPR-Cas12a干扰Tf1 逆转座且仍有残留的转座活性
3.4.3 通过延长cr RNA靶向作用,CRISPR-Cas12a可完全消除Tf1 转座活性
4 利用CRISPR-Cas13a编辑系统干扰裂殖酵母逆转录转座子Tf1 的转座
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 引物,质粒和菌株
4.2.2 试剂和仪器
4.3 实验方法
4.3.1 靶向Tf1 转录本的CRISPR-Cas13a系统构建
4.3.2 裂殖酵母逆转座子Tf1转座效率的测定
4.4 实验结果与分析
4.4.1 CRISPR-Cas13a靶向Tf1 RNA中间体干扰Tf1 逆转座
4.4.2 Tf1 转录本激活Cas13a不会诱导裂殖酵母细胞生长停滞
5 总结与展望
5.1 全文总结
5.2 展望
参考文献
附录A 基本实验操作
攻读学位期间发表的学术论文目录
致谢
本文编号：3815420
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