重组大肠杆菌全细胞催化L-DOPA合成羟基酪醇

发布时间：2023-05-17 19:56

　　羟基酪醇(hydroxytyrosol,HT)是一种主要存在于橄榄中的天然多酚类化合物,具有多种有益健康的生物学和药理学活性,如抗氧化、抗癌、抗菌、消炎、预防心脑血管疾病和糖尿病、保护视网膜和骨质,在医药、食品和化妆品等行业具有巨大的应用潜力。鉴于目前HT合成方法存在的不足,本研究提出了一种用重组大肠杆菌全细胞催化L-DOPA(L-3,4-二羟基苯丙氨酸)合成HT的方法,具有经济、简便和高效的特点,有望为HT的工业化生产和实际应用奠定基础。主要研究内容和结果如下:(1)在本实验室前期工作筛选出的芳香族氨基酸转氨酶(TyrB)、α-酮酸脱羧酶(PmKDC)、醛还原酶(YahK)和L-谷氨酸脱氢酶(GluDH)的基础上,提出了HT的合成途径。在这个途径中,L-DOPA通过TyrB的转氨作用转化为3,4-二羟基苯丙酮酸,后者进一步通过PmKDC的脱羧作用转化为3,4-二羟基苯乙醛,最后,3,4-二羟基苯乙醛被YahK还原成HT,同时巧妙利用GluDH将转氨反应和还原反应耦合起来,实现辅因子再生。以四酶混合催化的方式成功验证了该途径的可行性。(2)将这四个酶以双质粒共表达的方式构建了一系列共表...

【文章页数】：55 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 羟基酪醇简介
        1.1.1 HT的结构与性质
        1.1.2 HT的功能与应用
    1.2 HT的合成方法
        1.2.1 植物提取
        1.2.2 化学合成
        1.2.3 生物合成
    1.3 多基因共表达
    1.4 NAD(P)H辅酶再生
    1.5 全细胞催化
    1.6 立题依据
    1.7 研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株与质粒
        2.1.2 实验仪器设备
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 培养基及相关溶液
    2.2 实验方法
        2.2.1 E.coli感受态细胞的制备
        2.2.2 质粒DNA的提取和PCR产物纯化
        2.2.3 菌株的培养、诱导表达及全细胞催化剂的制备
        2.2.4 HT合成途径可行性验证
        2.2.5 HT的测定方法
        2.2.6 基因克隆和共表达菌株的构建
        2.2.7 琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE
        2.2.8 酶活的测定方法
        2.2.9 培养基优化和诱导条件优化
        2.2.10 全细胞催化及其条件优化
        2.2.11 HT的初步分离纯化
第三章 结果与讨论
    3.1 HT合成途径可行性验证
    3.2 共表达菌株的构建及其产HT能力比较
        3.2.1 共表达菌株的构建
        3.2.2 共表达菌株的产HT能力比较
        3.2.3 四酶共表达的验证
    3.3 培养基优化
        3.3.1 培养基种类优化
        3.3.2 碳源及其浓度优化
        3.3.3 氮源及其浓度优化
        3.3.4 无机盐及其浓度优化
        3.3.5 培养基组分配比的正交实验优化
    3.4 诱导条件优化
        3.4.1 诱导时机优化
        3.4.2 IPTG浓度优化
        3.4.3 诱导温度优化
        3.4.4 诱导时长优化
    3.5 全细胞催化条件优化
        3.5.1 pH优化
        3.5.2 温度优化
        3.5.3 转速优化
    3.6 优化条件下的HT合成
    3.7 HT的初步分离纯化
主要结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录1 :作者在攻读硕士学位期间的科研成果
附录2 :基因序列



本文编号：3817895