重组融合蛋白MBP-PAI的表达、纯化及酶活测定

发布时间：2023-06-05 01:45

　　为了解决亚油酸异构酶(Linoleic Acid Isomerase,PAI)在大肠杆菌中形成包涵体的问题,选择麦芽糖结合蛋白(Maltose-Binding Protein,MBP)标签和低温诱导表达系统pColdV,构建了大肠杆菌重组表达菌株E.coli BL21(pCold-Mpai),并对其诱导表达条件进行了优化。SDS-PAGE电泳结果显示,融合蛋白MBP-PAI成功表达,重组菌的最佳诱导表达条件为:诱导温度15℃、IPTG添加量0.1 mmol/L、诱导时间12 h,在该诱导条件下,与未融合MBP的PAI相比,MBPPAI的可溶性表达量为后者的18倍、酶活为后者的1.5倍。经过MBPTrap HP亲和层析柱纯化后,MBP-PAI纯蛋白质的比酶活为1.58 U/mg,能够转化亚油酸形成反10,顺12-共轭亚油酸。

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 菌株和质粒
    1.2 主要试剂
    1.3 培养基
    1.4 重组融合蛋白质表达载体的构建
    1.5 重组融合蛋白质诱导表达条件的优化
        1.5.1 诱导温度对MBP-PAI蛋白表达的影响
        1.5.2 诱导剂IPTG浓度对MBP-PAI蛋白表达的影响
        1.5.3 诱导时间对MBP-PAI蛋白表达的影响
    1.6 最佳诱导条件下MBP-PAI蛋白的可溶性表达量比较
    1.7 MBP-PAI重组蛋白的纯化
    1.8 酶活测定
2 结果与分析
    2.1 融合表达载体pCold-MPAI的构建及鉴定
    2.2 诱导温度对重组蛋白质表达的影响
    2.3 诱导剂IPTG浓度对MBP-PAI蛋白表达的影响
    2.4 诱导时间对MBP-PAI蛋白表达的影响
    2.5 最佳诱导条件下重组蛋白质的可溶性表达情况
    2.6 MBP-PAI重组蛋白的纯化
    2.7 MBP-PAI重组蛋白的酶活测定
3 结语



本文编号：3831438