相分离调控IRS-1无膜信号体与内质网互作的机制研究
发布时间：2023-12-27 17:58
多价相互作用介导的液-液相分离(liquid-liquid phase separation,LLPS)能够驱动应激颗粒、核仁和纺锤体等多个无膜区室形成。而且,相分离的异常与多种疾病密切相关。信号体(signalosomes)参与信号的起始和传递,其正确组装对于信号转导至关重要。然而,目前对于信号体的组装机制还知之甚少。最近研究表明,相分离参与信号分子成簇,调控信号转导。本研究中,我们发现胰岛素和IGF-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)信号通路中的关键节点蛋白,IRS-1(insulin receptor substrate 1,IRS-1),含有内部无序区域(intrinsically disordered region,IDR),能够在体外和细胞内驱动相分离。进一步,我们发现IRS-1存在分子间相互作用并鉴定了对于相分离液滴形成必要的关键区域HIR(homophilic interaction region,HIR)。而且,IRS-1能够作为支架蛋白通过相分离形成无膜信号体,招募下游信号蛋白,调控IGF-1信号传递。重要的是,IRS-1还能...
【文章页数】：129 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
致谢
中文摘要
Abstract
缩略词表
1 引言
2 材料与方法
2.1 主要仪器
2.2 主要试剂
2.2.1 试剂和耗材
2.2.2 抗体
2.2.3 质粒
2.3 实验方法
2.3.1 细胞培养及传代
2.3.2 细胞冻存
2.3.3 细胞复苏
2.3.4 质粒构建
2.3.5 质粒的抽提
2.3.6 质粒转染
2.3.7 siRNA敲降
2.3.8 GST融合蛋白制备
2.3.9 GST pull-down
2.3.10 内源蛋白免疫共沉淀(Co-IP)
2.3.11 外源蛋白免疫共沉淀(Co-IP)
2.3.12 蛋白免疫印迹(Western blot)
2.3.13 免疫荧光
2.3.14 FLAG-IRS-1 蛋白纯化
2.3.15 体外相分离
2.3.16 GDP和 GTPγS结合实验
2.3.17 亚细胞器组分分离
2.3.18 光漂白恢复实验(FRAP)
2.3.19 3D渲染和液滴参数计算
2.3.20 蛋白质内部无序区域预测和氨基酸含量比例
2.3.21 数据做图和统计分析
3 结果
3.1 IRS-1驱动液-液相分离
3.1.1 IRS-1在细胞内形成液滴样结构
3.1.2 IRS-1液滴样结构具有液滴样特性
3.1.3 IRS-1在体外驱动相分离
3.2 IRS-1通过分子间相互作用驱动相分离液滴形成
3.2.1 IRS-1 含有内部无序区域(IDR)
3.2.2 IRS-1300-600区域对于相分离液滴形成是必要的
3.2.3 IRS-1 HIR介导IRS-1 的分子间相互作用
3.3 IRS-1通过相分离形成无膜信号体
3.3.1 IRS-1 相分离液滴能够响应IGF-1 刺激
3.3.2 IRS-1通过相分离招募下游信号蛋白
3.3.3 酪氨酸残基调控IRS-1相分离液滴的形成
3.4 IRS-1 相分离对于IGF-1 信号传递是必要的
3.5 IRS-1无膜信号体与内质网相互作用
3.5.1 IRS-1无膜信号体与内质网形成动态接触
3.5.2 VAPB-IRS-1 相互作用促进IRS-1 无膜信号体与ER互作
3.5.3 IRS-1 600-800 区域介导IRS-1-VAPB相互作用
3.6 VAPB调控IRS-1 的周转和表达水平
3.6.1 内质网应激削弱IRS-1相分离
3.6.2 内质网应激削弱IRS-1和VAPB的共定位
3.6.3 VAPB通过泛素蛋白酶体系统调控IRS-1 表达水平
3.6.4 VAPB调控细胞中IRS-1 的周转
3.6.5 脂滴诱导物削弱IRS-1 相分离和VAPB-IRS-1 共定位
3.6.6 ALS疾病相关VAPBP56S突变体削弱IRS-1 表达水平
3.7 VAPB是 Rab5 的效应物蛋白
3.7.1 VAPB通过MSP结构域与Rab5 相互作用
3.7.2 VAPB-Rab5 相互作用形成ER-内体互作
3.7.3 VAPB与活化的Rab5 有更强的相互作用
3.8 Rab5 调控IRS-1 无膜信号体与ER互作
3.8.1 Rab5与IRS-1、VAPB共定位
3.8.2 Rab5 调控VAPB与 IRS-1 相互作用
4 讨论
参考文献
综述 生物相分离的形成机制及其翻译后修饰调控的研究进展
参考文献
作者简历及博士期间科研成果
本文编号：3875627
【文章页数】：129 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
致谢
中文摘要
Abstract
缩略词表
1 引言
2 材料与方法
2.1 主要仪器
2.2 主要试剂
2.2.1 试剂和耗材
2.2.2 抗体
2.2.3 质粒
2.3 实验方法
2.3.1 细胞培养及传代
2.3.2 细胞冻存
2.3.3 细胞复苏
2.3.4 质粒构建
2.3.5 质粒的抽提
2.3.6 质粒转染
2.3.7 siRNA敲降
2.3.8 GST融合蛋白制备
2.3.9 GST pull-down
2.3.10 内源蛋白免疫共沉淀(Co-IP)
2.3.11 外源蛋白免疫共沉淀(Co-IP)
2.3.12 蛋白免疫印迹(Western blot)
2.3.13 免疫荧光
2.3.14 FLAG-IRS-1 蛋白纯化
2.3.15 体外相分离
2.3.16 GDP和 GTPγS结合实验
2.3.17 亚细胞器组分分离
2.3.18 光漂白恢复实验(FRAP)
2.3.19 3D渲染和液滴参数计算
2.3.20 蛋白质内部无序区域预测和氨基酸含量比例
2.3.21 数据做图和统计分析
3 结果
3.1 IRS-1驱动液-液相分离
3.1.1 IRS-1在细胞内形成液滴样结构
3.1.2 IRS-1液滴样结构具有液滴样特性
3.1.3 IRS-1在体外驱动相分离
3.2 IRS-1通过分子间相互作用驱动相分离液滴形成
3.2.1 IRS-1 含有内部无序区域(IDR)
3.2.2 IRS-1300-600区域对于相分离液滴形成是必要的
3.2.3 IRS-1 HIR介导IRS-1 的分子间相互作用
3.3 IRS-1通过相分离形成无膜信号体
3.3.1 IRS-1 相分离液滴能够响应IGF-1 刺激
3.3.2 IRS-1通过相分离招募下游信号蛋白
3.3.3 酪氨酸残基调控IRS-1相分离液滴的形成
3.4 IRS-1 相分离对于IGF-1 信号传递是必要的
3.5 IRS-1无膜信号体与内质网相互作用
3.5.1 IRS-1无膜信号体与内质网形成动态接触
3.5.2 VAPB-IRS-1 相互作用促进IRS-1 无膜信号体与ER互作
3.5.3 IRS-1 600-800 区域介导IRS-1-VAPB相互作用
3.6 VAPB调控IRS-1 的周转和表达水平
3.6.1 内质网应激削弱IRS-1相分离
3.6.2 内质网应激削弱IRS-1和VAPB的共定位
3.6.3 VAPB通过泛素蛋白酶体系统调控IRS-1 表达水平
3.6.4 VAPB调控细胞中IRS-1 的周转
3.6.5 脂滴诱导物削弱IRS-1 相分离和VAPB-IRS-1 共定位
3.6.6 ALS疾病相关VAPBP56S突变体削弱IRS-1 表达水平
3.7 VAPB是 Rab5 的效应物蛋白
3.7.1 VAPB通过MSP结构域与Rab5 相互作用
3.7.2 VAPB-Rab5 相互作用形成ER-内体互作
3.7.3 VAPB与活化的Rab5 有更强的相互作用
3.8 Rab5 调控IRS-1 无膜信号体与ER互作
3.8.1 Rab5与IRS-1、VAPB共定位
3.8.2 Rab5 调控VAPB与 IRS-1 相互作用
4 讨论
参考文献
综述 生物相分离的形成机制及其翻译后修饰调控的研究进展
参考文献
作者简历及博士期间科研成果
本文编号：3875627
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3875627.html
