牛、果蝇DHX36解旋酶的表达纯化及活性比较

发布时间：2024-05-14 02:52

　　【目的】探索牛和果蝇DHX36解旋酶的表达纯化条件及底物结合活性,为深入研究DEAH-box解旋酶提供理论参考。【方法】以较高等动物牛(Bos taurus)和较低等动物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)RNA解旋酶BtDHX36和DmDHX36为研究对象,首先,构建重组表达载体pET15b-sumo-BtDHX36和pET15b-sumo-DmDHX36,将2种质粒分别转入表达菌株BL21(DE3)中,诱导表达2种目的蛋白,利用Ni-NTA层析柱、HisTrap SP HP柱纯化得到目的蛋白。然后,采用荧光各向异性法(FA)研究溶液和温度条件对2种蛋白底物结合活性的影响,以及二者的底物结合偏好性。最后利用快速停流-荧光共振能量转移(FRET)技术对2种DHX36的双链底物解旋活性进行比较。【结果】获得了纯度大于95%的全长BtDHX36和DmDHX36蛋白,2种DHX36解旋酶的最佳底物结合条件为:20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)、50 mmol/L NaCl、2 mmol/L MgCl₂、反应温度37℃。在此条件下...

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【部分图文】：

图1pET15b-sumo-BtDHX36和pET15b-sumo-DmDHX36表达载体构建（A）、双酶切检测（B）及蛋白表达纯化结果(C、D、E)

BtDHX36和DmDHX36表达载体构建过程见图1-A。用EcoRⅠ、XhoⅠ对重组载体进行双酶切鉴定,切出大小约为2.8kb的BtDHX36和DmDHX36基因片段(图1-B)。将重组表达载体转入表达菌E.coliBL21(DE3)18℃下诱导14h,目的蛋白BtD....

图2BtDHX36和DmDHX36解旋酶结合活性的条件优化

测定DHX36与底物的结合活性,将得到的各向异性值归一化并用米氏方程拟合,可得DHX36在不同条件下的米氏常数Km,结果见图2。由图2可知,氯化钠浓度、氯化镁浓度、pH以及温度均对DHX36的结合活性有一定影响,且对2种DHX36解旋酶的影响趋势一致。当氯化钠浓度为50mmol....

图3BtDHX36和DmDHX36解旋酶的底物结合偏好性比较

用16,24,32,42ntssDNA测定底物长度对BtDHX36和DmDHX36结合活性的影响,结果如图4所示。由图4可知,2种同源蛋白都能较好地结合4种ssDNA;对BtDHX36而言,16,24,32,42ntss-DNA的Km依次为(31.0±2.1),(30.3....

图4ssDNA底物长度对2种DHX36解旋酶结合活性的影响

图3BtDHX36和DmDHX36解旋酶的底物结合偏好性比较2.52种DHX36解旋酶解旋偏好性比较

本文编号：3973091