酵母高效克隆表达T载体pYES2-T的构建及应用

发布时间：2024-05-18 07:06

　　为了在酵母中高通量、高效率地对外源基因进行克隆和表达,本研究以酵母表达载体pYES2为基础,构建高效克隆表达T载体。pYES2是酿酒酵母的一种高效表达载体,在其多克隆位点处设计插入XcmⅠ-Intron-XcmⅠ片段,同时将其载体中URA3基因中原有的XcmⅠ酶切位点进行定点突变,构建出pYES2-T酿酒酵母高效表达T载体。利用XcmⅠ酶切载体pYES2-T,使其产生两个突出的T末端,一方面可以通过PCR产物加A的方式直接进行TA克隆;另一方面可在半乳糖诱导启动子的调控下,对TA克隆后的外源基因在酵母中诱导表达。利用该系统高通量地对人工合成耐盐系列基因NLEAs进行筛选,研究结果表明,该系统可以在酿酒酵母中一步式完成片段克隆及耐盐基因的筛选。本研究构建的酵母表达T载体使用方便、效率高、成本低,应用前景广阔。

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

图1片段XcmⅠ-Intron-XcmⅠ扩增

使用XcmⅠ限制性内切酶对构建好的酵母表达T载体pYES2-T进行酶切，电泳胶回收获得线性化的片段(图6A)。通过设计特异性引物扩增人工合成的耐盐片段nlea1基因(未发表数据)(图6B)，凝胶纯化并加A处理，连接线性化T载体。连接产物通过热激转化法转入大肠杆菌TOP10，并通过....

图2酶切载体pYES2

图1片段XcmⅠ-Intron-XcmⅠ扩增对该酵母表达载体进行功能验证，通过将连接液以及未经XcmⅠ酶切的pYES2-T载体转化酿酒酵母后直接在含有半乳糖以及400mmol/L和600mmol/LNaCl浓度梯度的尿嘧啶营养缺陷型培养基上培养，3d后对pYES2-T-....

图4pYES2-T载体

对该酵母表达载体进行功能验证，通过将连接液以及未经XcmⅠ酶切的pYES2-T载体转化酿酒酵母后直接在含有半乳糖以及400mmol/L和600mmol/LNaCl浓度梯度的尿嘧啶营养缺陷型培养基上培养，3d后对pYES2-T-nlea1重组菌株进行筛选及验证观察，结果表明....

图3pYES2-T测序验证

本研究以酵母表达载体pYES2为基础，对其进行改造，在其多克隆位点的SacⅠ和BamHⅠ酶切位点处插入XcmⅠ-Intron-XcmⅠ序列，构建出酵母表达T载体。pYES2具有尿嘧啶缺陷型标记，配合其抗性标记基因氨苄霉素可有效筛选出阳性克隆。其半乳糖诱导型启动子位于多克隆位点上....

本文编号：3976620