Neuritin原核表达载体构建及高表达菌株筛选

发布时间：2024-05-18 07:38

　　目的构建带有肠激酶序列的p ET32a-neuritin重组质粒,为后期酶切去除重组蛋白His标签奠定基础,并筛选高表达菌株。方法利用基因工程技术在p ET32a载体自身His标签和肠激酶序列之后克隆插入neuritin基因。首先PCR扩增目的基因neuritin,与原核表达载体p ET32a重组后,重组质粒转化DH5α感受态,采用菌落PCR、双酶切鉴定,并将鉴定阳性的重组质粒转化BL21感受态后,测序鉴定。阳性转化子经IPTG诱导表达蛋白后,SDSPAGE和Western blot鉴定重组蛋白。对50个阳性转化子的表达产物经SDS-PAGE鉴定其表达水平。结果菌落PCR、双酶切鉴定结果与预期相符,且测序结果比对正确。蛋白诱导表达后SDS-PAGE和Western blot结果证实是Neuritin蛋白。SDS-PAGE鉴定高表达菌株蛋白表达量,筛选出1株高表达菌株。结论本研究成功构建带有肠激酶序列的p ET32a-neuritin重组质粒,并获得高表达Neuritin蛋白菌株,为后期获得无标签重组Neuritin蛋白奠定基础。

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【部分图文】：

图1pET32a-neuritin重组质粒构建示意图

在pET32a载体自身His标签和肠激酶序列之后克隆插入neuritin基因，限制性内切酶分别为NcoI、XholI。2.2目的基因neuritin的PCR产物鉴定

图2neuritinPCR产物鉴定

PCR扩增neuritin产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在约300bp处出现特异性条带。与预期结果一致(图2)。2.3pET32a-neuritin重组质粒菌落PCR鉴定

图3重组质粒pET32a-neuritin菌落PCR鉴定

将neuritin的PCR产物和pET32a质粒的酶切产物进行连接并转化DH5α感受态后，对阳性转化子进行PCR鉴定。结果显示在300bp处出现特异性条带(图3)。2.4pET32a-neuritin重组质粒双酶切鉴定

图4重组质粒pET32a-neuritin双酶切鉴定

将菌落PCR鉴定阳性的转化子提取质粒，并用NcoI、XholI酶切重组质粒，经琼脂糖凝胶电泳检测可见约300bp片段和5000bp片段，与预期结果一致(图4)。结果表明neuritin基因已成功插入到pET32a载体中。2.5重组质粒pET32a-neuritin测序鉴....

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