携带VEGF165基因的心肌特异性重组腺相关病毒载体的制备和纯化研究

发布时间：2024-10-17 13:34

　　研究背景及目的目前临床治疗缺血性心脏病（IHD）的方法主要是常规药物治疗和血运重建治疗（经皮冠状动脉介入治疗、冠脉搭桥术等）。然而,即使接受药物或血运重建治疗的患者仍会出现反复心绞痛或心力衰竭等症状,而基因疗法在增加侧支血管生长,减少心肌缺血方面显示出较大潜力,是IHD治疗的希望。血管内皮生长因子（VEGF165）已被证明在心肌梗死后能发挥抗心肌细胞凋亡、诱导干细胞参与缺血心肌的修复以及提高心电稳定性等作用。因此,本研究选择VEGF165作为IHD基因治疗的靶基因。在基因载体的选择上,腺相关病毒（AAV）,因为免疫原性低、安全性高、组织特异性好、宿主范围广以及可介导外源基因长期稳定表达等优点,从几种病毒载体中脱颖而出,成为IHD最有前景的基因治疗载体。本研究中,我们选定具有心肌嗜性的血清型AAV9,联合心肌特异性的c Tn T启动子来介导VEGF165基因在心肌的长期稳定表达,以发挥持久有效的心肌保护作用。同时,重组腺相关病毒（rAAV）的规模化包装和纯化是制约rAAV药物研究快速发展的一个关键问题,存在着生产成本高、操作复杂、成品纯度差、回收率低以及空壳病毒较多等诸多问题。所以,本研究...

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1.1AAV的基因结构

前言2辅助下才能发生产毒性感染，生成子代AAV。AAV的基因组是长约4.7kb的单链DNA分子（图1.1），基因组包含两个开放阅读框（ORF）——Rep基因和Cap基因，以及两端约145bp的反向末端重复序列（Invertedterminalrepeats，ITRs）。Rep基因....

图2.1重组腺相关病毒rAAV9-cTnT-VEGF165-eGFP的制备与纯化技术路线

材料与方法192.2.实验技术路线图2.1重组腺相关病毒rAAV9-cTnT-VEGF165-eGFP的制备与纯化技术路线2.3.实验方法2.3.1.VEGF165基因序列的获取1）登录NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），在“Nucleot....

图2.1载体质粒pAAV-cTnT-eGFP的质粒图谱

材料与方法201)上游引物的选取：直接选择从起始密码子起，随后约20bp长度左右的一段序列作为初步设定的上游引物。随后通过增加或减少单个碱基，不断调整引物序列长度，使其尽可能满足引物设计原则中Tm值、GC含量等要求，进而确定上游引物的序列。2)下游引物的选取：选择从终止密码子端起....

图3.1VEGF165基因的PCR扩增

结果与分析38图3.1VEGF165基因的PCR扩增M：TaKaRa公司的DL2000marker；泳道1,2：均为VEGF165基因的PCR产物。3.4.载体质粒pAAV-cTnT-eGFP-VEGF165的构建及鉴定1）分别将提取的VEGF165基因和pAAV-cTnT-eG....

本文编号：4008077