中药黄芪蛋白诱导HepG2细胞发生程序性坏死机制研究
发布时间：2021-03-27 18:24
目的:蛋白质是生物大分子,其种类丰富、功能各异,某些纯蛋白制剂已经作为治疗疾病的药物被广泛应用,例如胰岛素。一些学者发现,天然蛋白物质具有抗肿瘤、抗炎和免疫等作用。研究表明,黄芪有着丰富的药用部位,其中黄芪糖蛋白对某些疾病具有免疫抑制的作用,但未知黄芪蛋白成分是否对肿瘤细胞的生长有影响。因此本文对黄芪蛋白成分进行提取纯化,对黄芪蛋白进行体外抗肿瘤活性筛选,进一步对其抑制肿瘤及其中机制进行探讨,同时结合转录组学RNA测序技术,希望能够提高黄芪活性成分的充分利用率,对蛋白类成分抗肿瘤研究提供实验基础。方法:黄芪通过水提盐析及脱盐,得到含有不同分子量的黄芪蛋白溶液。从三种不同的肿瘤细胞中筛选,选择受黄芪蛋白调控变化最显著的一种;细胞计数法计算黄芪蛋白对肿瘤细胞的增值抑制率;采用流式细胞术和PI染色法,观察肿瘤细胞的凋亡和坏死;进一步显微镜下Hoechst33342和PI共同染色,分辨活细胞与死细胞个数改变情况;Western Blot法检测凋亡标志蛋白PARP和caspase-3磷酸化水平、坏死标志蛋白RIP1含量变化;转录组学对比空白组与加药组,分析黄芪蛋白处理后基因差异表达与信号通路改变...
【文章来源】：山西中医药大学山西省
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
蛋白浓度标准曲线与凝胶电泳结果
根据图3得出：实验期间，在同一时间内，黄芪蛋白处理的浓度逐渐升高，同时HepG2细胞生长受到的抑制随之增强；在同一浓度下，黄芪蛋白处理的时间逐渐上升，同时HepG2细胞的细胞存活率呈现明显下调变化。根据细胞半数存活率的数值范围，最终选择最佳作用时间1-2d作为后续实验条件。通过细胞计数法，结果显示，HepG2细胞的增殖受黄芪蛋白的直接影响，增殖抑制作用呈现时间和浓度依赖性。其中与空白对照组相比，黄芪蛋白高浓度100μg/mL组细胞具有显著性差异（P<0.01），结果具有统计学意义。对照10μg/mL50μg/mL100μg/mL图3HepG2细胞结晶紫染色与生长曲线图（HepG2细胞经黄芪蛋白处理24h.n=3.x±s.与空白组相比*P<0.05,**P<0.01）3.2流式细胞术检测黄芪蛋白处理后HepG2细胞死亡数增多流式细胞仪检测HepG2细胞的凋亡和坏死。对流式结果的细胞凋亡图片进行分析，将图片分为四个象限：其中左下角（LL）象限代表正常细胞；左上角（UL）象限代表细胞碎片；右下角（LR）象限代表HepG2早期凋亡细胞；右上角（UR）象限代表晚期凋亡细胞或者坏死细胞。凋亡数值表示为：除LL象限，其余三象限数值总和。通过图4可以看出，随着黄芪蛋白处理浓度的升高（0、10、50、100μg/mL），
山西中医药大学2020届硕士学位论文20凋亡细胞所占总细胞比重呈现逐步上升的趋势，凋亡率由空白对照组的2%随黄芪蛋白浓度逐渐上升为5%、13%和22%。由于结果中UR象限中含有坏死细胞，并不能将坏死细胞和凋亡细胞直接分辨，凋亡结果无直接说明意义。因此，再次采用PI单染法，通过流式细胞仪，明确区分HepG2细胞发生了凋亡或者程序性死亡。不同浓度黄芪蛋白（0、10、50、100μg/mL）处理后的HepG2细胞经过PI染色，根据仪器操作，调试仪器将活细胞控制在LR象限中，而坏死细胞则分布在UR象限。根据图5流式图结果发现：坏死细胞随着黄芪蛋白浓度的增加而增多，得到HepG2细胞坏死率分别为（4.51±0.195）%、（7.39±0.27）%、（11.59±0.09）%、(18.78±0.34）%。结果可由此分析，与空白对照组相比，黄芪蛋白10μg/mL低浓度组的结果具有显著性差异（P<0.05），黄芪蛋白100μg/mL高浓度组的结果具有极显著差异（P<0.01）。说明黄芪蛋白致使肝癌细胞死亡，可能是通过使细胞发生程序性死亡，由此导致HepG2细胞的增殖受到抑制，而具体缘由需进一步探究。ABCD(注：A:0μg/mL;B:10μg/mL;C:50μg/mL;D:100μg/mL.）图4细胞凋亡流式结果（HepG2细胞经黄芪蛋白处理24h.n=3.x±s.与空白组相比*P<0.05,**P<0.01）
【参考文献】：
期刊论文
[1]UPLC-MS/MS法测定不同温度定向炮制黄芪中8种苷类和4种苷元成分的含量[J]. 刘蓬蓬,张凡,史辑,单国顺,贾天柱. 中国药房. 2020(03)
[2]蒙花苷通过调控IKK/NF-κB信号通路抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭[J]. 黄器伟,黄涛,牛美兰,张艳慧,李道明. 中国病理生理杂志. 2019(12)
[3]黄芪皂苷II抗肝癌肺转移效应及作用机理的研究[J]. 王敏,郑喜,祁燕,普晓佳,张霞,李小丝,刘蓓,万春平. 中药药理与临床. 2019(06)
[4]毛蕊异黄酮的研究进展[J]. 王睿,伍明桃,万玛索南,刘洪名,吕家鹏. 云南化工. 2019(10)
[5]补气类中药抗肿瘤的研究现状[J]. 黄志峰,李得堂. 中医肿瘤学杂志. 2019(05)
[6]黄芪多糖诱导淋巴细胞增殖及肿瘤细胞杀伤作用的研究[J]. 廖大忠. 四川中医. 2019(11)
[7]黄芪多糖联合洛铂对胃癌细胞的作用效果及分子机制[J]. 张明明,高伟,崔佳,于悦卿,李新新. 医学动物防制. 2019(12)
[8]基于“补气固表”探究黄芪黄酮组分抑制C57BL/6荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫调节机制研究[J]. 杨冰,于桂红,李明雨,顾慧敏,陈雅萍,封亮,贾晓斌. 中国中药杂志. 2019(23)
[9]植物叶蛋白提取及应用前景[J]. 于群. 化工设计通讯. 2019(10)
[10]转录组学主要研究技术及其应用概述[J]. 刘伟,郭光艳,秘彩莉. 生物学教学. 2019(10)
博士论文
[1]紫苏多肽分离纯化及其抗肿瘤活性研究[D]. 贺东亮.中北大学 2019
[2]蒙古黄芪的化学成分研究[D]. 马晓丰.沈阳药科大学 2003
硕士论文
[1]黄芪总黄酮联合顺铂对Lewis肺癌小鼠的抗癌作用研究[D]. 齐彦爽.山西大学 2019
[2]人参蛋白质的提取及其对乳腺癌MCF-7细胞的抗肿瘤作用研究[D]. 任雨贺.长春中医药大学 2019
[3]毛蕊异黄酮对结直肠癌细胞株HCT116增殖凋亡的影响及机制的研究[D]. 李通.广西医科大学 2016
[4]野生型斜茎黄芪生物碱成分与营养成分分析及其毒性评价[D]. 温伟利.西北农林科技大学 2013
本文编号：3103983
【文章来源】：山西中医药大学山西省
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
蛋白浓度标准曲线与凝胶电泳结果
根据图3得出：实验期间，在同一时间内，黄芪蛋白处理的浓度逐渐升高，同时HepG2细胞生长受到的抑制随之增强；在同一浓度下，黄芪蛋白处理的时间逐渐上升，同时HepG2细胞的细胞存活率呈现明显下调变化。根据细胞半数存活率的数值范围，最终选择最佳作用时间1-2d作为后续实验条件。通过细胞计数法，结果显示，HepG2细胞的增殖受黄芪蛋白的直接影响，增殖抑制作用呈现时间和浓度依赖性。其中与空白对照组相比，黄芪蛋白高浓度100μg/mL组细胞具有显著性差异（P<0.01），结果具有统计学意义。对照10μg/mL50μg/mL100μg/mL图3HepG2细胞结晶紫染色与生长曲线图（HepG2细胞经黄芪蛋白处理24h.n=3.x±s.与空白组相比*P<0.05,**P<0.01）3.2流式细胞术检测黄芪蛋白处理后HepG2细胞死亡数增多流式细胞仪检测HepG2细胞的凋亡和坏死。对流式结果的细胞凋亡图片进行分析，将图片分为四个象限：其中左下角（LL）象限代表正常细胞；左上角（UL）象限代表细胞碎片；右下角（LR）象限代表HepG2早期凋亡细胞；右上角（UR）象限代表晚期凋亡细胞或者坏死细胞。凋亡数值表示为：除LL象限，其余三象限数值总和。通过图4可以看出，随着黄芪蛋白处理浓度的升高（0、10、50、100μg/mL），
山西中医药大学2020届硕士学位论文20凋亡细胞所占总细胞比重呈现逐步上升的趋势，凋亡率由空白对照组的2%随黄芪蛋白浓度逐渐上升为5%、13%和22%。由于结果中UR象限中含有坏死细胞，并不能将坏死细胞和凋亡细胞直接分辨，凋亡结果无直接说明意义。因此，再次采用PI单染法，通过流式细胞仪，明确区分HepG2细胞发生了凋亡或者程序性死亡。不同浓度黄芪蛋白（0、10、50、100μg/mL）处理后的HepG2细胞经过PI染色，根据仪器操作，调试仪器将活细胞控制在LR象限中，而坏死细胞则分布在UR象限。根据图5流式图结果发现：坏死细胞随着黄芪蛋白浓度的增加而增多，得到HepG2细胞坏死率分别为（4.51±0.195）%、（7.39±0.27）%、（11.59±0.09）%、(18.78±0.34）%。结果可由此分析，与空白对照组相比，黄芪蛋白10μg/mL低浓度组的结果具有显著性差异（P<0.05），黄芪蛋白100μg/mL高浓度组的结果具有极显著差异（P<0.01）。说明黄芪蛋白致使肝癌细胞死亡，可能是通过使细胞发生程序性死亡，由此导致HepG2细胞的增殖受到抑制，而具体缘由需进一步探究。ABCD(注：A:0μg/mL;B:10μg/mL;C:50μg/mL;D:100μg/mL.）图4细胞凋亡流式结果（HepG2细胞经黄芪蛋白处理24h.n=3.x±s.与空白组相比*P<0.05,**P<0.01）
【参考文献】：
期刊论文
[1]UPLC-MS/MS法测定不同温度定向炮制黄芪中8种苷类和4种苷元成分的含量[J]. 刘蓬蓬,张凡,史辑,单国顺,贾天柱. 中国药房. 2020(03)
[2]蒙花苷通过调控IKK/NF-κB信号通路抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭[J]. 黄器伟,黄涛,牛美兰,张艳慧,李道明. 中国病理生理杂志. 2019(12)
[3]黄芪皂苷II抗肝癌肺转移效应及作用机理的研究[J]. 王敏,郑喜,祁燕,普晓佳,张霞,李小丝,刘蓓,万春平. 中药药理与临床. 2019(06)
[4]毛蕊异黄酮的研究进展[J]. 王睿,伍明桃,万玛索南,刘洪名,吕家鹏. 云南化工. 2019(10)
[5]补气类中药抗肿瘤的研究现状[J]. 黄志峰,李得堂. 中医肿瘤学杂志. 2019(05)
[6]黄芪多糖诱导淋巴细胞增殖及肿瘤细胞杀伤作用的研究[J]. 廖大忠. 四川中医. 2019(11)
[7]黄芪多糖联合洛铂对胃癌细胞的作用效果及分子机制[J]. 张明明,高伟,崔佳,于悦卿,李新新. 医学动物防制. 2019(12)
[8]基于“补气固表”探究黄芪黄酮组分抑制C57BL/6荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫调节机制研究[J]. 杨冰,于桂红,李明雨,顾慧敏,陈雅萍,封亮,贾晓斌. 中国中药杂志. 2019(23)
[9]植物叶蛋白提取及应用前景[J]. 于群. 化工设计通讯. 2019(10)
[10]转录组学主要研究技术及其应用概述[J]. 刘伟,郭光艳,秘彩莉. 生物学教学. 2019(10)
博士论文
[1]紫苏多肽分离纯化及其抗肿瘤活性研究[D]. 贺东亮.中北大学 2019
[2]蒙古黄芪的化学成分研究[D]. 马晓丰.沈阳药科大学 2003
硕士论文
[1]黄芪总黄酮联合顺铂对Lewis肺癌小鼠的抗癌作用研究[D]. 齐彦爽.山西大学 2019
[2]人参蛋白质的提取及其对乳腺癌MCF-7细胞的抗肿瘤作用研究[D]. 任雨贺.长春中医药大学 2019
[3]毛蕊异黄酮对结直肠癌细胞株HCT116增殖凋亡的影响及机制的研究[D]. 李通.广西医科大学 2016
[4]野生型斜茎黄芪生物碱成分与营养成分分析及其毒性评价[D]. 温伟利.西北农林科技大学 2013
本文编号：3103983
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