嵌合TCR分子在T细胞中表达、组装和功能的研究

发布时间：2017-10-28 07:30

  本文关键词：嵌合TCR分子在T细胞中表达、组装和功能的研究

  更多相关文章： TCR基因治疗 错配 嵌合TCR γδTCR CD3ζ

【摘要】：研究背景和目的T细胞受体(TCR)是T细胞表面能够识别和结合蛋白质抗原的特异性受体。当机体受到肿瘤抗原刺激时,由TCR对APC呈递的靶细胞表面抗原肽-MHC复合物识别抗原。TCR在细胞免疫中发挥着重要的靶向性作用,TCR基因修饰的T细胞过继性转移可以诱导某些特定的T细胞瞬时增殖,并允许引入T细胞池中没有的特异性TCR,增强免疫系统介导的对肿瘤细胞的消除,因此在转TCR基因免疫治疗中,将识别肿瘤抗原的特异性TCR基因导入患者T细胞,可使患者的无能T细胞重新获得具有肿瘤抗原识别和应答的能力。利用抗原特异性TCR基因修饰T细胞进行过继性移植/回输,是近年来获得较高关注的一种特异性的癌症新疗法。Rosenberg领导的研究团队于2006年完成了应用TCR基因治疗黑色素肿瘤患者的人体临床试验。在Ⅰ期临床试验中,利用逆转录病毒将特异性识别黑色素瘤相关MART-1抗原的TCR基因修饰T淋巴细胞,扩增出大约109-1010 MART-1特异性T细胞,然后转导入HLA-A2限制性转移性黑色素瘤患者。实验结果观察到17名患者中的2名肿瘤细胞持续性减少,而且在治疗完成一年后仍可检测到基因修饰的TCR表达。这项试验第一次证明了TCR基因治疗在临床应用的可行性,也为转TCR基因免疫治疗提供了实践依据。虽然上述研究证明了TCR基因治疗的可行性和潜在应用前景,但是仍面临很多问题,关键问题之一是外源性的TCRα和β链与内源性的α和β链之间会相互识别配对形成杂合TCR。我们实验室前期从肝癌患者的肿瘤组织中成功筛选分离出一种特异性TCR (Val2和Vβ7),经研究表明,在转导的T细胞中TCRα12和β7的表达低于内源性TCRap的水平,并且外源导入的TCRa12和β7链与内源性TCR产生了错配TCRo TCR错配这种现象被认为广泛存在于TCR基因治疗中,并导致引入的有治疗意义的TC(?) kαβ分子在表面表达被稀释,细胞表面的转TCR表达量下降、细胞活性降低。此外错配TCR还可能形成一种能产生未知特异性的新的TCR,这种新的TCR会在转TCR基因治疗中带来自身免疫性(on-target)或交叉反应(off-target)毒性。虽然目前TCR错配引起的自身反应疾病还没有临床证据,但是由杂合TCR所带来的自身免疫风险却不容忽视。实际上,表达错配TCR分子的T细胞在高浓度IL-2条件下扩增已经在临床前模型中被证实会引起移植物抗宿主病(GvHD)。因此转TCR在T细胞的表达和配对组装以及与pMHC的亲和力都是TCR基因治疗充分发挥抗肿瘤能力的关键。因此如何改造修饰转TCR基因使得转TCRα链和β链能在T细胞表面正确配对,并且其表达效率和亲和力都增强,同时避免产生具有on-target或off-target毒性的未知TCR成为近年来TCR基因治疗的一个热点之一。比如有研究者采用以下方法来减少转TCR的错配：在TCR链中引入二硫键；采用鼠源性保守C区替换人TCR分子的C区；将TCRa和β链接口处保守结构域的氨基酸残基翻转；单链TCR (scTCR)嵌合体；将TCR链的C区与CD3分子融合；将aβTCR基因转入γδT细胞中等。综上所述,目前虽然提出了策略对转TCR基因进行修饰以优化外源TCR分子的配对,但仍然有很多需要改进的地方,比如在TCR分子的C区引入二硫键的改造策略使得TCR转T细胞的新反应性减少,但是错配TCR依然存在。鼠源化C区替换人C去的改造方法由于鼠源片断的免疫原性,很可能诱导宿主产生HAMA (Human anti-mouse antibody),因此这一方法很难应用在临床治疗上。翻转TCRα和β链接口处保守结构域的氨基酸残基的改造方法虽然在一定程度上解决了TCR错配问题,但是外源TCR优先配对的能力有限,并且pMHC结合能力和T细胞重定向功能都不理想。对于单链TCR构象能否保持稳定、同CD3分子的结合是否有效等仍有待研究。因此还需要寻找其他一些方法对TCR分子进行改造,在降低错配产生的条件下还能够保持抗原识别特异性。本研究将针对我们实验室从肝癌患者中成功分离出的一种特异性TCR(Val2和Vβ7)分子进行改造,在综合国内外相关领域的最新研究进展的基础上,我们设计了4种修饰的TCR分子,命名为Chimeric TCR (chimTCR)。改造方案一,根据之前研究认为αβTCR不会与γδTCR形成错配,且αβTCR与γδTCR同属TCR家族,同源性较高。因此,我们据此设计了3种嵌合γδTC R结构域的嵌合型αβTCR,第一种嵌合TCR (chimeric1 TCR)将αβTCR的C区替换为γ8TCR的C区但是保留αβTCR的近膜茎部区、跨膜区和胞内区,形成三明治结构：第二种嵌合TCR (chimeric2 TCR)将apTCR的C区的近膜茎部区、跨膜区和胞内区替换为γδTCR C区的近膜茎部区、跨膜区和胞内区；第三种嵌合TCR (chimeric3 TCR)将αβTCR的整个C区结构域都替换为γδTCR的整个C区。改造方案二,由于TCR的胞内区很短,没有转导信号的序列,需要与胞内CD3分子的信号亚基结合来转导抗原刺激信号,因此,第四种嵌合TCR我们将αβTCR C区的近膜茎部区、跨膜区和胞内区替换为CD3ζ全长。我们对这4种嵌合TCR展开研究,一方面研究这些嵌合TCR分子是否能够避免与内源TCR错配；另一方面由于目前对于TCR分子各个结构域的功能尚不是很清楚,我们也期望通过对结构域替换的嵌合TCR的研究初步探讨aβTCR或γδTCR结构域的功能。整个研究分为4部分进行。首先采用分子克隆从健康人外周血中钓取y982TCR和CD3ζ全长,然后运用生物信息学方法对α12β7TCR、y982TCR和CD3ζ的一级结构序列特点进行分析,并进行二级结构预测,初步确定结构域替换位点之后对嵌合TCR分子的三级结构进行预测并优化融合位点；然后针对生物信息学预测的结构域替换位点设计了4套重叠PCR引物,克隆并鉴定了携带荧光蛋白的嵌合TCR双表达载体pIRES-chimTRBYFP-chimTRACFP以及不含荧光蛋白的腺病毒穿梭质粒pDC315-chimTRB-IRES-chimTRA,包装腺病毒；接着将这些嵌合TCR分子转染受体细胞,分析嵌合TCRa和p链在细胞表面的表达以及配对组装能力；最后通过FRET方法分析了chimTCR 与 CD3ζ的相互作用,另外研究了嵌合TCR转T细胞的CTL效应及细胞因子分泌的能力,通过共定位分析了chim4TCR在T细胞中信号初始状态。综上,本课题希望对结构域替换后的嵌合TCR分子的配对组装情况、结合CD3分子的能力、以及识别抗原和传递活化信号的能力的研究,为TCR基因修饰T细胞的过继性治疗研究及其临床应用研究奠定基础。一、yδTCR基因的获取及嵌合TCR分子生物信息学分析该部分研究目的是确定apTCR, γδTCR, CD3ζ结构域替换位点,设计出结构稳定合理的嵌合TCR分子。在正常人外周血中除了αβT细胞外(约占CD3+T细胞的95%),还有一种γδT细胞(约占CD3+T细胞的5%)。由于健康人外周血中γδTT细胞Vγ9链总是和Vδ2链一起表达(大多数健康人的Vγ9Vδ2 T细胞占外周血γδT细胞的50%～95%)。因此我们首先由健康人PBMC分离获得γδTCR基因类型TCRVy9和TCRVδ2的基因序列,并与实验室之前分离的αβTCR基因亚型在IMGT数据库进行了一级序列比对分析。由健康人PBMC分离的CD3ζ采用Uniprot数据库对其一级结构进行分析。应用Jpred 和 PredietionProtein服务器预测TCRα12、β7、γ9、δ2和CD3ζ的二级结构。应用TMHMM等5种跨膜程序预测TCRα12、β7、γ9、δ2和CD3ζ的跨膜螺旋结构。应用Swiss-Model在线服务同源模建法进行TCRα12、β7、γ9和δ2三维结构的预测。最后应用Swiss-Model搜索出的比分最高的模板,采用软件Modeller9V7对嵌合TCR分子进行三维结构模拟,并与原αβTCR分子之间的蛋白骨架以及抗原识别活性部位进行了空间结构比对和空间位置分析。结果IMGT数据库比对分析确定了我们筛选分离获得的TCRα12、β7、γ9和δ2链V-D-J或V-J连接区基因共同编码的CDR3高变区。二级结构预测显示在V结构域的CDR3高变区后都存在一个折叠区域,之后以一段loop形式与TCR的C区结构域相连接。综合比较几种跨膜软件预测结果,确定了TCRα12、β7、γ9、δ2和CD3ζ的跨膜区域。三维结构预测结果发现TCRα12与TCRδ2结构的同源性较高,TCRβ7和TCRγ9结构的同源性较高,并与预测的二级结构进行比较最终确定了结构域替换的位点。对嵌合TCR分子的三维建模结果显示,嵌合TCR分子能维持原αβTCR蛋白V区结构的稳定。因此,该部分通过生物信息学分析确定了结构域替换位点成功设计了4种嵌合TCR分子,且这些嵌合TCR分子的结构域具有良好的稳定性。二、嵌合TCR分子的克隆以及腺病毒的包装本部分的研究目的是构建一组可用于FRET检测的含荧光蛋白的嵌合TCR分子双表达载体,以及一组不含荧光蛋白的嵌合TCR腺病毒穿梭载体并包装出具有感染能力的腺病毒。我们针对第一章确定的结构域融合位点采用primer premier5.0和Oligo6.0成功设计了4套重叠PCR引物。通过重叠PCR一步法获得chimTRA-CFP和chimTRB-YFP融合基因。chimTRA-CFP经BstX Ⅰ和Not Ⅰ双酶切插入质粒pIRES2-EGFP的IRES下游替换EGFP蛋白获得重组质粒pIRES2-chimTRA/CFP； chimTRB-YFP经Nhe Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切插入上述重组质粒pIRES2-chimTRA/CFP中IRES上游的多克隆位点,得到重组双表达载体pIRES2-chimTRB/YFP-chimTRA/CFP,并进行测序鉴定。以同样的方法构建不含荧光蛋白的腺病毒双表达载体pIRES2-chimTRB-chimTRA,然后将chimTRB-IRES-chimTRA表达盒插入质粒pDC315中,获得嵌合TCR的重组腺病毒穿梭载体pDC315-chimTRB-IRES-chimTRA, 并进行测序鉴定。将pDC315-chimTRB-IRES-chimTRA与Ad5/F35重组嵌合型腺病毒骨架质粒 pBHGIoxdeE 1 Cre共转染HEK-293细胞进行嵌合TCR重组腺病毒的包装,并采用TCID50方法进行滴度测定,通过PCR对各重组腺病毒基因组进行检测,转染Jukat细胞后流式鉴定嵌合TCR的表达及摸索最佳感染复数和感染时间。统计学处理：实验数据以均数±标准差来表示。应用SPSS(?) v19.0软件(SPSS Inc., Chicago, USA)进行统计分析。各指标先进行正态性及Levene's test方差齐性检验。两因素两水平数据比较采用2×2析因设计,分析两种干预交互作用、单独效应及主效应,采用t检验与单因素方差分析进行单因素分析,多重比较使用LSD法。当P0.05时,被认为差异具有统计学意义。结果成功设计了4套重叠PCR引物,并通过重叠PCR一步法成功获得chimTCRa 和 chimTCRβ的融合基因；成功构建了4种含荧光蛋白的真核双表达载体pIRES-chimTRBYFP-chimTRACFP;成功构建了4种不含荧光蛋白的腺病毒穿梭质粒pDC315-chimTRB-IRES-chimTRA,并包装出了具有感染能力的重组腺病毒,通过PCR验证chimTCRs整合至病毒基因组中；4种重组嵌合腺病毒的滴度都在109IU/ml以上,并可有效转染Jukat细胞,以MOI=100 (PFU)感染时间为48h时,嵌合TCR的表达效率最高。因此,本部分成功构建了含荧光蛋白的4种嵌合TCR分子的双表达载体,另外成功构建了不含荧光蛋白的嵌合TCR腺病毒穿梭载体并包装出了具有感染能力的重组嵌合腺病毒。三、嵌合TCR分子的表达和配对组装分析本部分的目的是研究嵌合TCR分子在受体细胞的表达水平、自身的配对能力以及与内源TCR分子的错配程度。将这4种携带荧光蛋白的重组表达质粒pIRES-chimTRBYFP-chimTRACFP转染BEL-7402和Jurkat细胞,并通过激光扫描共聚焦显微镜扫描转染细胞,其中458nm激发波长激发供体chimTRACFP.515 nm激发波长激发受体chimTRBYFP,然后扫描细胞获得荧光图像,其中扫描ECFP通道获得青色荧光图象,EYFP通道获得黄色荧光图象。然后利用致敏受体发射方法(sensitized acceptor emission method, SE)进行分析获得pFRET和FRET效率荧光图片,接着每个样本选择4组细胞的FRET效率荧光图片,并在每组细胞FRET效率荧光图片上随机选取5个兴趣点(ROI)的荧光值进行进一步的统计学分析,比较各嵌合TCR分子的相互作用,确定其与内源TCR的错配情况。将4种不携带荧光蛋白的嵌合TCR重组腺病毒转染Jurkat细胞,72h后收获细胞,并以TCRVp7-PE、TCR Va12-FITC抗体染色,流式细胞术检测各嵌合TCR分子Vβ7和Vα12的表达。统计学处理：实验数据以均数±标准差来表示。应用SPSS(?) v19.0软件(SPSS Inc., Chicago, USA)进行统计分析。各指标先进行正态性及Levene's test方差齐性检验。两因素两水平数据比较采用2×2析因设计,分析两种干预交互作用、单独效应及主效应,采用t检验与单因素方差分析进行单因素分析,多重比较使用LSD法。当P0.05时,被认为差异具有统计学意义。结果显示4种携带荧光蛋白的嵌合TCR分子能定位于细胞膜表面并正常表达,特别是chim4TCR在没有CD3分子存在的情况下也能非常强烈的表达于细胞表面,这意味着chim4TCR在细胞中的表达可以不依赖于CD3分子。SE-FRET以及统计学分析发现,chim1TCR 和 chim2TCR在两种细胞的FRET效率都高于wtTCR,但是依然与内源TCR产生了少量的杂合TCR分子。虽然chim1TCR和chim2TC R在Jurkat细胞中不能避免错配,但相比于、vtTC R在一定程度上减少了错配。chim3TCR和chim4TCR在BEL-7402细胞和Jurkat细胞的FRET效率无统计学差异,这提示chim3TCR和chim4TCR能避免错配。流式细胞术检测结果发现chimlTCR、chim2TCR 和 chim4TCR在Jurkat细胞表面的表达水平高于wtTCR,而chim3TCR在Jurkat细胞表面的表达效率最低,特别是chim4TCR相比于未经改造的wtTCR及其他3种嵌合TCR其表面表达水平大大提高。因此,该部分研究表明chim4TCR不仅能够避免与内源TCR的错配,且其在T细胞系以及非T细胞系表面表达水平都远远高于另3种chimTCR分子和wtTCR分子。chim3TCR虽然能避免错配但是表达水平却相比于wtTCR有所下降。chim1TCR 和 chim2TCR其表达相比于wtTCR稍有提高但是不能避免错配。四、嵌合TCR基因转染T细胞功能的研究该部分的目的是研究各chimTCR分子与CD3ζ的相互作用及信号传递能力,分析各chimTCR分子转染T细胞后对肿瘤细胞的CTL效应及细胞因子分泌情况以探讨其抗原识别能力,最后检测了chim4TCR在细胞内的信号初始状态。通过第一章生物信息学分析的各TCR与CD3ζ的跨膜区域和胞内区域,设计了能采用FRET方法分析TCR与CD3ζ相互作用的一对携带荧光蛋白的质粒。构建了作为供体的4种pIRES-chimTRB-chimTRACFP质粒和作为受体的pIRES-CD3ζTMYFP 和 pIRES-CD3ζFP重组质粒。将以上质粒分别共转染BEL-7402细胞,激光共聚焦扫描显微镜扫描CFP和YFP在BEL-7402细胞内的表达,SE-FRET分析嵌合TCR与CD3ζ的相互作用。分离健康人PBMC,并筛选出HLA-A2+阳性样本,将、vtTCR及4种chimTCR的重组腺病毒转染PBMC并设未转染TCR对照组,72h后与HLA-A2-的靶细胞HepG-2, Huh-1以及HLA-A2"的靶细胞BEL-7402以效靶比30：1～1：1共孵育,作用4h后采用钙黄绿素(Calcein-acetoxymethyl, CAM)释放法检测各组TCR转PBMC对肿瘤细胞的杀伤效应；24h后ELISA检测各组TCR转PBMC的IFN-γ分泌水平。最后分别转染重组质粒chim4TCRYFP或CD3ζYFP至BEL-7402和Jurkat细胞,采用DiD对细胞膜进行染色,激光共聚焦扫描显微镜以515 nm激发波长和635nm激发波长分别激发YFP和DiD,发射波长由500nm-700nm扫描细胞获得荧光图像,之后通过细胞膜共定位分析chim4TCR在细胞内信号初始状态。统计学处理：实验数据以均数±标准差来表示。应用SPSS() v19.0软件(SPSS Inc., Chicago, USA)进行统计分析。各指标先进行正态性及Levene's test方差齐性检验。数据比较采用析因设计,分析两种干预交互作用、单独效应及主效应。采用单因素方差分析和t检验完成单因素数据分析,多重比较使用LSD法。当P0.05时,被认为差异具有统计学意义。结果显示wtTCR和前3种嵌合γδTCR的chimTCR分子与CD3ζTM的FRET效率较低,提示这些TCR与CD3ζ在BEL-7402细胞中的相互作用较弱。而chim4TCR与CD3ζ能明显检测到FRET,提示chim4TCR中融合的CD3ζ依然能与CD3ζ有一定的相互作用,但是其程度低于chim4TCRαζ和 chim4TCRPβζ之间的相互作用。另外细胞毒实验结果表明chim4TCR、chim1TCR 和 wtTCR转染PBMC细胞能有效杀伤HLA-A2+的靶细胞,其中chim4TCR对靶细胞的裂解能力高于chim1TCR和wtTCR。但是chim2TCR和chim3TCR转PBMC与未转TCR的PBMC对HLA-A2+的靶细胞的杀伤效应没有统计学差异,提示chim2TCR和chim3TCR可能在识别特异性抗原或信号传递方面能力受损。各组chimTCRs以及、vtTC R转染T细胞对HLA-A2-的靶细胞没有表现出杀伤效应。此外作用于HLA-A2+的靶细胞后,chim4TCR、wtTCR和chim1TCR基因转染PBMC能分泌的IFN-γ,其中chim4TCR基因转染组分泌的IFN-γ高于wtTCR 和 chim1TCR基因转染组,而chim2TCR和chim3TCR与未经转染TCR的对照组相比无统计学差异。作用于HLA-A2-的靶细胞BEL-7402后,IFN-γ分泌水平均没有显著性差异。最后通过细胞膜共定位分析发现Chim4TCR或CD3ζ都共定位于膜上,确定了Chim4TCR在T细胞内信号属于未活化的初始状态。因此,该部分研究证实Chim4TCR依然能与CD3ζ有一定的相互作用；Chim4TCR、chim1TCR依然保持原wtTCR的HLA-A2限制性,并具有良好的抗原特异性及信号传递能力,chim2TCR 和 chim3TCR可能失去了抗原识别能力或是信号传递能力受损而不足以促进细胞因子的分泌；另外chim4TCR在T细胞中的信号状态是可控的。
【关键词】：TCR基因治疗 错配 嵌合TCR γδTCR CD3ζ
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R450
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-27
• 前言27-41
• 参考文献35-41
• 第一章 γδTCR基因的获取及嵌合TCR分子生物信息学分析41-60
• 引言41-42
• 1.1 实验材料42-44
• 1.2 实验方法44-46
• 1.3 结果46-57
• 1.4 讨论57-58
• 小结58-59
• 参考文献59-60
• 第二章 嵌合TCR分子的克隆以及腺病毒的包装60-95
• 引言60-61
• 2.1 材料与设备61-63
• 2.2 实验方法63-80
• 2.3 结果80-91
• 2.4 讨论91-92
• 小结92-93
• 参考文献93-95
• 第三章 嵌合TCR分子的表达和配对组装分析95-113
• 引言95-96
• 3.1 材料与设备96-97
• 3.2 实验方法97-103
• 3.3 结果103-108
• 3.4 讨论108-110
• 小结110-111
• 参考文献111-113
• 第四章 嵌合TCR基因转染T细胞功能的研究113-154
• 引言113-115
• 4.1 材料与设备115-116
• 4.2 实验方法116-124
• 4.3 实验结果124-145
• 4.4 讨论145-149
• 小结149-151
• 参考文献151-154
• 研究展望154-155
• 附录155-158
• 攻读博士学位期间成果158-159
• 致谢159-161
• 统计学审稿证明161

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本文编号：1107254