Porcupine依赖的Ku70蛋白棕榈酰化在DNA损伤应答中的作用及机制研究

发布时间：2021-09-05 02:25

　　目的:基因组不稳定是肿瘤的特征之一。DNA损伤应答（DDR）是预防基因组不稳定性的主要机制,也是影响细胞对电离辐射（IR）和许多化疗药物敏感性的重要因素。阐明DDR通路所涉及的分子调控机制对于理解肿瘤发生和干预肿瘤治疗具有重要意义。蛋白质棕榈酰化作为一种重要的蛋白翻译后修饰形式,可调控蛋白质的稳定性、转运及蛋白之间的相互作用等过程。近年研究发现棕榈酰化在恶性肿瘤的发生发展中起重要作用,但是其在基因组稳定性及DNA损伤修复机制中的功能尚不明确。Porcupine（PORCN）蛋白是膜结合的O-酰基转移酶,通常存在于内质网膜。本论文研究重点是阐明细胞核内的PORCN蛋白对DDR及肿瘤放射敏感性的调控机制。方法:为了探究细胞核内PORCN在DDR中的作用,首先采用慢病毒载体的PORCN sh RNA建立PORCN敲低的稳定细胞系。然后采用可以抵抗sh RNA敲低的PORCN-WT及PORCN-ΔNLS质粒转染细胞并建立PORCN突变的HT1080稳定细胞系。通过克隆形成实验检测细胞的放射敏感性,MTS实验检测细胞的增殖能力,免疫荧光实验检测细胞核内DNA损伤修复蛋白γ-H2AX的表达变化。通... 

【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校

【文章页数】：118 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

PORCN缺失的细胞表现为放疗敏感性增强

1.2.2 PORCN 缺失细胞基因组稳定性降低。1.2.2.1 PORCN 缺失细胞电离辐射后 DNA 损伤修复尚未完成时进入有丝分裂期。一般认为细胞完成 DNA 损伤的修复后才进入有丝分裂期，以保证将准确无误的遗传信息传递给子代细胞，进而维持基因组的稳定性。DNA 双链断裂（DSB）时可诱导组蛋白 H2AX 发生磷酸化形成 γ-H2AX，所形成的 γ-H2AX 灶点数与DSBs 的数目成线性相关关系，也就是说一个 γ-H2AX 灶点代表有一个 DSB 发生。目前 γ-H2AX 的荧光染色已经作为检测 DSBs 的重要方法。为了观察有丝分裂期细胞的 DNA 损伤修复状况，采用 PORCN-WT 细胞及 PORCN 缺失的细胞，给予细胞 6Gy 的照射剂量，并进行 γ-H2AX 免疫荧光染色观察，由图 2 所示，电离辐射 48h 后 PORCN-WT 细胞中未观察到 γ-H2AX 灶点（红色荧光小点）存在，而 PORCN 缺失的细胞在有丝分裂期仍然有 γ-H2AX 灶点存在，表明 PORCN 缺失的细胞在进行有丝分裂时 DNA 损伤修复尚未完成，增加了将错误遗传信息传递到子细胞的风险。

天津医科大学博士学位论文灶点代表 DNA 损伤情况。1.2.2.2 PORCN 缺失细胞电离辐射后微核化、多核化、异倍体出现的比率显著增加。如果有丝分裂过程中，持续发生错误，将会导致染色体不稳定。表现为微核化、多核化、异倍体出现的比率增加。本研究采用 PORCN-WT 细胞及 PORCN缺失的细胞铺板，细胞贴壁后给予细胞 6Gy 的照射剂量，分别在照射后 0 小时，24 小时，48 小时，72 小时固定细胞，并进行姬姆萨染色，如图 3A，B 所示，通过统计分析发现与PORCN-WT细胞相比PORCN缺失的HT080细胞在电离辐射 24 小时后微核化、多核化、异倍体出现的比率显著增加。


本文编号：3384484