MEN1基因对奶牛乳腺上皮细胞细胞周期调控机制的研究

发布时间：2017-10-10 18:25

  本文关键词：MEN1基因对奶牛乳腺上皮细胞细胞周期调控机制的研究

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【摘要】：奶牛的产奶量主要取决于乳腺上皮细胞的数量及其分泌活性,增加乳腺上皮细胞的数量对提高产奶量具有重要意义。MEN1编码menin蛋白,在细胞增殖分裂、细胞周期调控以及转录调节、基因组稳定等过程中发挥重要作用。MEN1基因是多发性内分泌肿瘤1型综合征的关键致病基因之一,对于特定组织中细胞的异常增殖起到了诱发的作用。另一方面,MEN1对于机体的正常代谢起着重要的调控作用。乳腺是一个重要的代谢器官。本研究拟探讨menin在奶牛的乳腺组织及其乳腺上皮细胞中的功能。研究发现不同生理阶段的奶牛乳腺组织中MEN1/menin表达存在表达变化,进而通过过表达/RNAi干扰技术,发现奶牛乳腺上皮细胞中MEN1/menin表达变化可以改变细胞的生长和增殖。主要研究结果如下：1.利用RT-PCR、WB、免疫组化方法分别检测不同泌乳阶段的奶牛乳腺组织MEN1/Menin的表达变化。menin蛋白阳性点主要位于乳腺腺泡及乳腺导管的上皮细胞中,不同生理阶段的奶牛乳腺组织中MEN1 mRNA水平存在表达变化,menin蛋白各组之间无差异。2.成功建立了真核细胞奶牛Menin蛋白过表达转染体系。利用基因重组技术,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-Myc-His-bmenl;将重组载体分别转染奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠成肌细胞(C2C12),分别在24h、48h、72h检测目的基因/蛋白的表达,结果表明在3种细胞中转染24h后过表达效果最好,在MAC-T、CHO、C2C12细胞中menin过表达效率分别达到4.41、5.65、1.93倍。3.将真核表达载体转染MAC-T细胞,结果表明转染组MEN1基因表达显著升高(P0.01),在转染后24h表达量最高,转染组是对照组的27.5倍,menin蛋白的过表达倍数为4.41倍。4.成功建立了真核细胞奶牛Menin蛋白限量表达体系。将siRNA转染进MAC-T细胞中,结果表明转染sibMEN-1/2/324h后,MEN1基因在mRNA和蛋白表达水平相比对照组均最低并达到极显著(P0.01),干扰效率分别为75%、71%。5.在过量/限量表达menin的条件下,利用CCK-8、流式细胞术和qRT-PCR技术,从不同角度都证明menin可以调控奶牛乳腺上皮细胞的增殖以及细胞周期。menin过表达对细胞增殖及细胞周期没有显著影响；menin限量表达能显著提高G1期细胞百分比,降低S期百分比(P0.05),CyclinD3、CyclinB2、CDK6基因的表达显著升高,CyclinD1的表达显著降低(P0.05)。
【关键词】：MEN1 过表达 限量表达 pcDNA3.1-Myc-His-bmen1 siRNA 细胞增殖
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S823
【目录】：

• 英文缩略词5-9
• 中文摘要9-11
• Abstract11-13
• 1 前言13-21
• 1.1 乳腺13-14
• 1.1.1 乳腺的结构和功能13
• 1.1.2 乳腺的发育和泌乳过程13
• 1.1.3 泌乳周期内乳腺细胞的增殖和凋亡13-14
• 1.2 细胞周期14-17
• 1.2.1 细胞周期时顺调控机制14-17
• 1.2.2 细胞周期监控机制17
• 1.3 MEN1基因研究进展17-21
• 1.3.1 MEN1基因概述17-18
• 1.3.2 Menin与转录调节18
• 1.3.3 Menin与基因组稳定18-19
• 1.3.4 Menin与细胞增殖19-20
• 1.3.5 Menin与细胞凋亡20
• 1.3.6 Menin与细胞周期20-21
• 1.4 Menin与乳腺21
• 1.5 本研究的目的意义21
• 2 材料与方法21-38
• 2.1 试验材料21-23
• 2.1.1 奶牛乳腺组织21-22
• 2.1.2 主要仪器22
• 2.1.3 主要试剂及来源22-23
• 2.1.4 常用试剂的配制23
• 2.2 试验方法23-38
• 2.2.1 奶牛MEN1基因过表达载体的构建23-27
• 2.2.2 siRNA的构建27
• 2.2.3 无内毒素质粒大量提取27-28
• 2.2.4 奶牛乳腺上皮细胞系的培养28-29
• 2.2.5 中国仓鼠卵巢细胞(CHO)培养29
• 2.2.6 小鼠成肌细胞(C2C12)培养29
• 2.2.7 奶牛乳腺上皮细胞的生物学性状检测29-30
• 2.2.8 转染奶牛乳腺上皮细胞系30
• 2.2.9 转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)30-31
• 2.2.10 转染小鼠成肌细胞(C2C12)31
• 2.2.11 组织/细胞总RNA提取与检测31-33
• 2.2.12 荧光定量PCR33-35
• 2.2.13 Western blot35-37
• 2.2.14 CCK-8法检测细胞增殖37
• 2.2.15 流式细胞术检测细胞周期37-38
• 2.3 统计分析38
• 3 结果38-58
• 3.1 不同泌乳阶段奶牛乳腺组织MEN1/menin的表达分析38-40
• 3.1.1 不同泌乳阶段奶牛乳腺组织MEN1 mRNA的表达分析38-39
• 3.1.2 不同泌乳阶段奶牛乳腺组织menin蛋白的表达分析39
• 3.1.3 不同泌乳阶段奶牛乳腺组织menin蛋白的表达部位分析39-40
• 3.2 奶牛MEN1基因真核表达载体的构建40-41
• 3.2.1 MEN1基因的PCR扩增结果40-41
• 3.2.2 重组载体的酶切鉴定41
• 3.2.3 重组质粒的测序鉴定41
• 3.3 奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)的生物学性状检测41-43
• 3.3.1 奶牛乳腺上皮细胞的形态观察41-42
• 3.3.2 奶牛乳腺上皮细胞生长曲线42-43
• 3.4 真核细胞奶牛Menin过表达转染体系的建立43-48
• 3.4.1 MAC-T细胞转染pcDNA3.1-Myc-His-bmen1载体最佳条件的确定43-44
• 3.4.2 CHO细胞转染pcDNA3.1-Myc-His-bmen1载体最佳条件的确定44-46
• 3.4.3 C2C12细胞转染pcDNA3.1-Myc-His-bmen1载体最佳条件的确定46-48
• 3.5 MAC-T细胞中转染siRNA条件的确定48-52
• 3.5.1 MAC-T细胞转染siRNA后MEN1 mRNA的表达分析50
• 3.5.2 MAC-T细胞转染siRNA后Menin蛋白的表达分析50-52
• 3.6 Menin过表达对MAC-T细胞的影响52-54
• 3.6.1 Menin过表达对MAC-T细胞增殖的影响52
• 3.6.2 Menin过表达对MAC-T细胞周期的影响52-54
• 3.6.3 Menin过表达对细胞周期相关因子的表达分析54
• 3.7 Menin限量表达对MAC-T细胞的影响54-58
• 3.7.1 Menin限量表达对MAC-T细胞增殖的影响54-55
• 3.7.2 Menin限量表达对MAC-T细胞周期的影响55-57
• 3.7.3 Menin限量表达对细胞周期相关因子的表达分析57-58
• 4 讨论58-61
• 4.1 MEN1/Menin在奶牛不同生理阶段的乳腺组织中的表达58-59
• 4.2 真核细胞中奶牛MEN1/Menin过表达转染体系的建立59
• 4.3 Menin过表达对细胞的影响59-60
• 4.4 Menin限量表达对细胞的影响60-61
• 5 结论与研究展望61-63
• 5.1 结论61
• 5.2 创新点61
• 5.3 研究展望61-63
• 参考文献63-70
• 致谢70

【参考文献】

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本文编号：1007915