转录因子ZmNAM056调控玉米淀粉合成相关基因表达的初探

发布时间：2017-10-25 08:18

  本文关键词：转录因子ZmNAM056调控玉米淀粉合成相关基因表达的初探

  更多相关文章： 玉米淀粉 关键基因 ZmNAM056转录因子 表达模式 瞬时表达 酵母单杂交

【摘要】：玉米(Zea may L.)是世界第一大粮食作物,种植面积和产量均居三大粮食作物之首,玉米淀粉也是各种植物淀粉中化学成分最佳的淀粉之一。如今,随着世界人口的日益增加,资源及耕地面积的日益减少,对作物产量及品质的要求也就越来越高。淀粉的生物合成过程的核心包括ADPG的合成,多糖链的延伸,多糖链的的分支,多糖链的去分支。淀粉的生物合成是一个十分复杂的过程,是在一系列酶的共同催化下完成的,在籽粒胚乳中淀粉合成的最后阶段涉及四类非常关键的酶类：腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase, AGPase)、淀粉合成酶(Starch synthase, SS)、淀粉分支酶(Starch branching enzyme, SBE)和淀粉去分支酶(Starch debranching enzyme, DBE)。目前对于淀粉相关合成酶的功能研究做得相对成熟,但对于淀粉合成相关酶的上游调控机制研究,即淀粉合成相关酶的顺式作用元件和反式作用因子的研究报道较少。我们根据文献报道和现有基因资源选取在玉米胚乳中特异表达或高表达的参与淀粉合成关键酶编码的8个基因：Sh2、Bt2、SSⅠ、SSⅡa, SSⅢa、sbel、sbeⅡb、 Isal。课题组前期通过RNA-seq测定玉米籽粒灌浆时期不同关键点胚乳RNA表达谱,筛选了可能参与玉米胚乳淀粉合成的转录因子；同时利用公共数据库通过共相关分析、筛选与上述8个淀粉合成相关基因表达相关的转录因子,取相关系数极高的转录因子列为候选转录因子。我们比较通过这两种方法筛选到的候选转录因子,发现了一个共同的NAC家族的转录因子,并命名为ZmNAM056。在此基础之上采用半定量RT-PCR或荧光定量PCR、基因瞬时表达、酵母单杂交以及亚细胞定位继续验证筛选的转录因子对淀粉合成关键酶基因表达的调控作用,具体结果如下：1以玉米优良骨干自交系B73为实验材料,我们成功从玉米胚乳中克隆到该转录因子,该基因含有一个编码391个氨基酸的开放阅读框。其他植物氨基酸序列进行同源比对,发现ZmNAM056转录因子含有NAC转录因子特有的N端DNA结合结构域和C端转录激活结构域。2对ZmNAM056基因表达模式进行了分析。半定量PCR结果表明ZmNAM056基因在籽粒中特异表达；随后实时荧光定量PCR,结果表明ZmNAM056基因在授粉后前7天的籽粒中表达量较低,授粉后10天开始大量表达,授粉后20天达到最高,并且发现同玉米胚乳淀粉合成相关基因表现出极强的正相关。同时还研究了不同糖类和植物激素对胚乳淀粉合成相关基因及ZmNAM056基因表达的影响,结果发现其中AGPase基因Brittle-2、Shrunken-2在所处理条件下其表达趋势是一致的,都受Glu、Suc、ABA的诱导,Fru、Tre的抑制；淀粉合成酶类(SSs)基因,SSⅡa受Glu的显著诱导,却不受ABA的诱导,SSⅢa受ABA的显著诱导,却不受Glu的诱导,SSI受Glu跟ABA的显著诱导；淀粉合成分支酶类(SBE)基因BEI受Tre、Suc的显著诱导,而SBEⅡb受Fru、Glu的显著诱导。这些结果说明同一个基因在不同处理条件下,其表达是有很大差异的,不同基因在相同条件处理时,有些基因的表达趋势是一致的,而有些表达趋势又是有差异的。其中蔗糖、葡萄糖、ABA对这些基因的表达影响较大。ZmNAM056基因的表达却不受蔗糖的影响；激素ABA跟葡萄糖促进ZmNAM056基因的表达,有趣的是蔗糖跟ABA协同处理时,促进效果更明显。3构建35S::ZmNAM-GFP融合蛋白表达载体,通过基因枪轰击介导洋葱表皮细胞进行亚细胞定位,结果表明ZmNAM056编码蛋白定位于细胞核中；通过酵母转化实验分析表明,ZmNAM056基因编码蛋白具有转录激活性。同时克隆玉米ZmNAM056蛋白的编码序列连接入pET-28载体,在大肠杆菌RosettaTM(DE3)菌株中进行原核表达,然后通过Ni-Agarose柱纯化6×His-ZmNAM056融合蛋白。4通过基因枪轰击介导玉米胚乳的瞬时表达实验以及酵母单杂交实验验证转录因子ZmNAM056同淀粉合成相关基因启动子的结合作用情况,发现ZmNAM056上调Sh2、Bt2基因的表达很有可能是通过间接的作用调控的；对SSⅡa、sbellb基因的上调和对sbe1基因的抑制是通过直接与其启动子结合从而调控其基因的转录。
【关键词】：玉米淀粉 关键基因 ZmNAM056转录因子 表达模式 瞬时表达 酵母单杂交
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S513
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 缩写表9-13
• 1 文献综述13-22
• 1.1 淀粉的结构和基本性质13
• 1.2 淀粉的生物合成13-14
• 1.3 淀粉合成关键酶14-18
• 1.3.1 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)14-15
• 1.3.2 淀粉合成酶(SS)15-16
• 1.3.3 淀粉分支酶(SBE)16-17
• 1.3.4 淀粉去分支酶(DBE)17
• 1.3.5 淀粉磷酸化酶(SP)17-18
• 1.4 淀粉合成相关基因的表达调控18-21
• 1.4.1 时空表达的调控18-19
• 1.4.2 糖与激素诱导表达的调控19-20
• 1.4.3 淀粉合成相关基因的转录调控研究进展20-21
• 1.5 研究目的和意义21-22
• 1.6 实验技术路线22
• 2. 材料和方法22-41
• 2.1 实验材料22-24
• 2.1.1 植物材料22
• 2.1.2 质粒载体及菌种22-23
• 2.1.3 主要试剂和试剂盒23
• 2.1.4 主要溶液23-24
• 2.1.5 主要培养基24
• 2.2 实验方法24-41
• 2.2.1 半定量RT-PCR24-27
• 2.2.2 ZmNAM056基因的克隆27
• 2.2.3 不同时期胚乳淀粉积累和荧光定量PCR27-28
• 2.2.4 淀粉合成关键酶基因启动子的克隆及活性验证28-33
• 2.2.5 转录因子ZmNAM056与淀粉合成酶关键基因启动子的瞬时表达33-35
• 2.2.6 酵母单杂交35-37
• 2.2.7 目的基因的亚细胞定位37-38
• 2.2.8 目的基因的酵母激活验证38
• 2.2.9 糖与激素对淀粉合成关键基因ZmNAM056基因的表达影响38-39
• 2.2.10 原核表达39-41
• 3 结果与分析41-57
• 3.1 目的基因半定量RT-PCR表达分析41-43
• 3.2 ZmNAM056基因的克隆43-45
• 3.3 不同时期胚乳淀粉积累结果45-46
• 3.4 不同胚乳时期淀粉合成关键基因及ZmNAM056基因相对定量表达46-49
• 3.5 淀粉合成关键酶基因启动子活性验证49
• 3.6 胚乳中过表达ZmNAM056基因对关键基因启动子活性的影响49-50
• 3.7 酵母单杂交50-52
• 3.8 ZmNAM056基因编码蛋白的亚细胞定位52-53
• 3.9 ZmNAM056基因编码蛋白的转录激活活性分析53
• 3.10 各基因在不同处理下的荧光定量PCR结果53-55
• 3.11 ZmNAM056基因编码蛋白的原核表达55-56
• 3.12 ZmNAM056基因原核表达蛋白的WB检测56-57
• 4 讨论57-63
• 4.1 玉米淀粉合成关键基因的表达分析57-58
• 4.2 ZmNAM056基因的功能域表达分析58-60
• 4.3 ZmNAM056基因调控玉米淀粉合成相关基因的转录60-61
• 4.4 后续实验的研究思路61-63
• 参考文献63-67
• 致谢67

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