对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28和VP26与细胞穿膜肽的融合蛋白在毕赤酵母中的组成型表达研究

发布时间：2017-10-26 15:10

  本文关键词：对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28和VP26与细胞穿膜肽的融合蛋白在毕赤酵母中的组成型表达研究

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【摘要】：白斑综合征病毒(WSSV)是危害全球对虾养殖业最严重的病原体之一,给对虾养殖带来了巨大危害。虽然目前还没有有效地控制该病毒蔓延的方法,但是随着wssv基因组测序的完成,该病毒结构基因的组成与功能越来越清晰,这为研究病毒侵染对虾细胞的机制奠定了基础。在研究病毒侵染对虾机制的过程中,研究者们发现病毒的某些囊膜蛋白在启动病毒感染的发生或介导病毒的侵入方面起着重要作用,其中VP28和VP26就是两种非常重要的病毒囊膜蛋白。越来越多的研究表明将一些重要的病毒囊膜蛋白导入对虾体内后,能够增强对虾抗WSSV侵染的能力,而这一研究结果促进了wssv蛋白质亚单位疫苗的诞生。然而蛋白亚单位疫苗的本质是蛋白质,在通过口服的方式免疫对虾时,由于无法以蛋白质大分子的形式被吸收,而达不到很好的免疫效果,因此需要寻求能够携带大分子货物穿越细胞膜的载体—细胞穿膜肽(CPPs)的帮助。本研究首先利用毕赤酵母表达系统成功表达了CPPs-GFP的融合蛋白,所选用的CPPs分别是TAT、R9和Penetratin,并证明CPPs可以携带蛋白质GFP(绿色荧光蛋白)活体穿过克氏原螯虾的肠系膜进入到虾体的血液循环中,然后到达各个组织。在此基础上,再次利用毕赤酵母表达系统成功分泌性表达了VP28和VP26与CPPs的融合蛋白,为WSSV蛋白质亚单位疫苗规模化生产提供了基础数据。具体研究内容与结果如下：1.TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP融合蛋白在毕赤酵母中成功分泌性表达。首先,提取pTracer-CMV2质粒作为扩增GFP基因的模板,并且根据TAT、 R9和Penetratin的氨基酸序列利用Codon Adaptation Tool软件设计了适合在酵母中表达的核酸序列,通过引物悬挂法将这些核酸序列添加到了GFP基因的5’端。选择表达载体pGAPZαA的EcoRI和XbaⅠ双限制性内切酶酶切位点,因此在目的基因的两端也分别添加了EcoRⅠ和XbaⅠ的核酸序列。然后,将酶切后的目的基因插入到表达载体中,转化TOP10大肠杆菌感受态细胞,经博莱霉素(Zeocin)抗性筛选阳性克隆,通过测序后可知重组表达载体成功构建。其次,重组质粒经限制性内切酶BlnⅠ (AvrⅡ)酶切线性化之后,电击转化毕赤酵母X-33感受态细胞,经Zeocin抗性筛选得到阳性转化子。最后,SDS-PAGE蛋白质电泳检测重组酵母表达上清目的蛋白的表达情况,结果表明本研究成功利用毕赤酵母表达系统表达了GFP、TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP蛋白,分子量大小约在29kDa。2.检测CPPs携带蛋白质分子穿膜的效果。实验室小规模发酵获得GFP、TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP目的蛋白,经冷冻干燥后获得蛋白上清冷冻干粉,接着用PBS配制成10mg/ml的蛋白母液。用克氏原螯虾作为实验动物,活体灌喂等体积等浓度的GFP、TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP的蛋白溶液,同时灌喂等体积的PBS作为阴性对照。灌喂两小时后分别取样鳌虾的中肠、心脏和肌肉组织进行冷冻切片分析,利用荧光倒置显微镜可以观察到,灌喂TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP的蛋白溶液组的鳌虾的肠道、心脏和肌肉可以看到明显的荧光,而灌喂GFP蛋白液的鳌虾仅在肠道中看到微弱的荧光,阴性对照没有观察到任何荧光。3.VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9融合蛋白在毕赤酵母中组成型分泌表达。根据Genbank中WSSV的基因序列设计引物,以WSSV粗提液为模板进行普通PCR扩增,得到VP28和VP26基因。同样用引物悬挂法将TAT和R9的核酸序列添加到VP28、VP26和GFP基因的3’端,并且添加EcoRI和XbaI酶切位点。目的基因经过双酶切、与表达载体连接、线性化、转化毕赤酵母和筛选重组酵母这一系列分子克隆操作过程后,成功得到了重组酵母。SDS-PAGE电泳分析毕赤酵母表达上清的目的蛋白,经考马斯亮蓝R-250染色发现GFP-TAT和GFP-R9表达上清有明显条带,蛋白分子量大小在29kDa左右,但是没有检测到VP28-TAT/R9和VP26-TAT/R9重组蛋白的存在。随后,采用更灵敏的蛋白质检测方法—蛋白质银染法,结果发现VP28-TAT/R9和VP26-TAT/R9表达上清组有明显的条带,证明VP28和VP26及其与TAT和R9的融合蛋白在毕赤酵母中成功表达,蛋白分子量大小约为32kDa。
【关键词】：白斑综合征病毒 细胞穿膜肽 VP28 VP26 分泌表达 毕赤酵母
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S945.4
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 引言15-17
• 第一章 文献综述17-28
• 第一节 WSSV疫苗研究进展17-22
• 1 前言17-18
• 2 对虾白斑综合征病毒的结构蛋白18-19
• 3 DNA疫苗19-20
• 4 蛋白质亚单位疫苗20-21
• 5 总结21-22
• 第二节 细胞穿膜肽的研究进展22-26
• 1 前言22-23
• 2 细胞穿膜肽的结构特点23-24
• 3 细胞穿膜肽的穿膜机制24-26
• 4 细胞穿膜肽的应用26
• 第三节 本实验的研究目的和意义26-28
• 1 研究目的26-27
• 2 研究意义27-28
• 第二章 克氏原螯虾口服毕赤酵母表达的三种穿膜肽与GFP的融合蛋白穿肠膜效果的比较28-65
• 第一节 表达载体的构建29-45
• 1 材料和方法29-39
• 1.1 材料29-31
• 1.1.1 实验仪器29
• 1.1.2 实验试剂29-31
• 1.1.3 引物设计31
• 1.2 实验方法31-39
• 1.2.1 GFP基因的克隆31-33
• 1.2.2 TAT-GFP、R9-GFP和Pentratin-GFP目的片段的获得33-35
• 1.2.3 目的基因的连接及转化35-36
• 1.2.4 目的基因俊落PCR鉴定及测序36-37
• 1.2.5 CPPs-GFP质粒和pGAPZaA表达质粒的提取37
• 1.2.6 质粒DNA的双酶切及切胶回收37-38
• 1.2.7 pGAPZaA-目的基因表达载体的构建38
• 1.2.8 重组表达质粒转化大肠杆菌Top1038
• 1.2.9 重组质粒的菌落PCR鉴定38-39
• 2 实验结果39-44
• 2.1 目的基因的PCR扩增39-42
• 2.1.1 GFP基因的获得39-40
• 2.1.2 TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP基因的获得40-41
• 2.1.3 目的基因菌落PCR鉴定41-42
• 2.2 重组表达质粒载体构建与PCR鉴定42-44
• 2.2.1 目的基因质粒双酶切结果42
• 2.2.2 重组质粒PCR鉴定42-44
• 2.2.3 重组质粒DNA测序44
• 3 小结44-45
• 第二节 目的基因在毕赤酵母中的分泌表达及穿膜效果初步研究45-65
• 1 材料与方法45-55
• 1.1 材料45-47
• 1.1.1 实验动物45
• 1.1.2 实验仪器45
• 1.1.3 实验试剂45-47
• 1.1.4 引物设计47
• 1.2 实验方法47-55
• 1.2.1 重组质粒的大量提取47-48
• 1.2.2 重组质粒Bln Ⅰ酶切线性化48-49
• 1.2.3 重组质粒转化毕赤酵母49-51
• 1.2.4 重组毕赤酵母PCR鉴定51-53
• 1.2.5 重组酵母表达产物的检测53-54
• 1.2.6 冷冻干燥目的蛋白54-55
• 1.2.7 重组蛋白体内肠道穿膜观察55
• 2 结果55-59
• 2.1 重组质粒在毕赤酵母分泌表达结果55-58
• 2.1.1 重组质粒Bln Ⅰ酶切线性化55-56
• 2.1.2 重组酵母PCR鉴定56-57
• 2.1.3 重组酵母发酵上清SDS-PAGE电泳结果57-58
• 2.2 细胞穿膜肽携带GFP穿膜效果58-59
• 2.2.1 GFP肠道穿膜观察58-59
• 2.2.2 GFP心脏和肌肉穿膜结果59
• 3 小结与讨论59-65
• 3.1 小结59-60
• 3.2 讨论60-65
• 3.2.1 毕赤酵母的电击转化60
• 3.2.2 重组酵母PCR鉴定60-65
• 第三章 WSSV囊膜蛋白VP28、VP26与穿膜肽的融合蛋白在毕赤酵母中的表达65-83
• 第一节 VP28和VP26表达载体的构建65-75
• 1 材料与方法65-70
• 1.1 实验材料65-66
• 1.1.1 主要仪器65
• 1.1.2 实验试剂65
• 1.1.3 引物65-66
• 1.2 实验方法66-70
• 1.2.1 VP28和VP26基因的获得66-67
• 1.2.2 VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9目的片段的扩增67-69
• 1.2.3 VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9基因的连接及转化69-70
• 1.2.4 菌落PCR鉴定及测序70
• 1.2.5 VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9质粒提取70
• 1.2.6 VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9重组表达质粒的构建70
• 2 实验结果70-74
• 2.1 目的基因的PCR扩增70-73
• 2.1.1 VP28、VP26和GFP基因的获得70-71
• 2.1.2 VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9基因的获得71-72
• 2.1.3 菌落PCR鉴定72-73
• 2.2 重组表达质粒构建及菌落PCR鉴定73-74
• 3 小结与讨论74-75
• 3.1 小结74
• 3.2 讨论74-75
• 第二节 VP28和VP26在毕赤酵母中分泌表达75-83
• 1 材料与方法75-77
• 1.1 材料75-76
• 1.1.1 实验试剂75-76
• 1.1.2 实验仪器76
• 1.2 实验方法76-77
• 1.2.1 重组表达质粒大量提取76
• 1.2.2 表达质粒线性化76
• 1.2.3 表达质粒转化毕赤酵母及PCR检测76
• 1.2.4 重组酵母表达产物的检测76-77
• 2 结果77-81
• 2.1 重组酵母PCR检测结果77-81
• 2.1.1 重组质粒线性化77-78
• 2.1.2 重组酵母PCR鉴定结果78-79
• 2.1.3 重组酵母发酵上清SDS-PAGE电泳结果79-81
• 3 小结与讨论81-83
• 3.1 小结81
• 3.2 讨论81-83
• 第四章 全文总结与展望83-84
• 1 全文总结83
• 2 展望83-84
• 参考文献84-91
• 致谢91-92
• 个人简历92
• 已发表和拟发表的论文92

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4 侯s，

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