VPg蛋白在兔出血症病毒翻译起始过程中的作用研究

发布时间：2017-10-26 19:37

  本文关键词：VPg蛋白在兔出血症病毒翻译起始过程中的作用研究

  更多相关文章： 兔出血症病毒 VPg蛋白 eIF4E 反向遗传学

【摘要】：兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(RHDV)引起的一种急性、致死性传染病。深入开展该病原的基础研究,可以为RHD的综合防治提供理论依据和技术支持。由于兔出血症病毒缺乏在体外增殖培养的细胞系,严重阻碍了其分子生物学的基础研究。VPg蛋白为RHDV的非结构蛋白,与病毒基因组RNA 5′-末端共价相连。近年来,在杯状病毒科其它成员的研究中发现,VPg蛋白在诺瓦克病毒和猫杯状病毒的翻译和复制中发挥重要作用。但VPg蛋白在RHDV生命过程中的功能还不清楚。鉴于此,本研究利用蛋白质互作、RNA干扰及反向遗传学等技术研究VPg蛋白在RHDV翻译起始过程中的功能;此外,为了克服体外增殖培养的瓶颈,我们还利用反向遗传学技术,人工构建了可在兔源细胞中稳定增殖的RHDV突变体,为深入研究VPg蛋白的生物学功能及病毒的致病机制和疫苗等提供了良好的平台。本论文研究内容主要包括以下3个方面:(1)构建了pLOV-3Flag-VPg重组质粒,然后利用慢病毒包装系统,成功获得了稳定表达RHDV VPg蛋白的细胞系,并命名为RK-VPg细胞。经过PCR、RT-PCR和Western blot实验的鉴定,结果表明RK-VPg细胞系能稳定高效的表达VPg蛋白。RK-VPg细胞系为研究VPg蛋白在RHDV生命周期中的作用提供了良好的平台。(2)通过定点突变RHDV衣壳蛋白表面高度变异区(V1)的第305位和第307位氨基酸,构建了含突变位点RGD的RHDV基因组全长重组质粒pRHDVRGD。然后,将该质粒转染至RK-13细胞中,盲传三代后出现典型细胞病变。IFA、Western blot、RT-PCR和透射电子显微镜检测结果均证明成功拯救出RHDVRGD突变株。该人工构建RHDV不仅能够在RK-13细胞中稳定增殖传代,而且继承了母本毒株的生物学特性。将收获的第35代RHDVRGD接种试验兔,在48~72h内,动物死亡,表现出典型兔瘟症状。将RHDVRGD细胞培养物灭活后免疫试验兔可以抵抗野毒的侵袭。总之,本研究人工构建的RHDVRGD继承了母本毒株的生物学特性,具有良好免疫原性,为研究兔瘟病毒的致病机理、分子生物学以及研发RHDV细胞灭活疫苗奠定了基础。(3)利用反向遗传学技术,构建了缺失VPg基因的RHDV复制子(pRHDV-luc/?VPg)和感染性克隆(pRHDVRGD-?VPg),在细胞水平证明了VPg是RHDV翻译所必需的蛋白;分别利用哺乳动物双杂交、免疫共沉淀和双分子荧光互补等技术在体外证明RHDV VPg蛋白可与真核细胞翻译起始因子eIF4E相互作用,从而揭示了VPg在RHDV基因组翻译起始过程中发挥作用的分子基础,即VPg蛋白在RHDV基因组翻译起始阶段充当帽子类似物的功能。综上所述,本论文分别构建了稳定表达RHDV VPg蛋白的细胞系和能在兔源细胞系中稳定增殖的RHDVRGD。在此基础上,首次证明VPg是RHDV翻译所需要的蛋白,其发挥作用的分子基础在于它能够与eIF4E相互作用,发挥帽子类似物的功能。上述研究成果不仅解决了长期以来兔瘟病毒不能够用细胞培养的难题,而且为深入研究兔瘟病毒的翻译、复制和细胞疫苗等奠定了基础。
【关键词】：兔出血症病毒 VPg蛋白 eIF4E 反向遗传学
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-14
• 英文缩略表14-15
• 第一章 引言15-24
• 1.1 兔出血症病毒概述15-16
• 1.2 杯状病毒与宿主相互作用研究进展16-19
• 1.2.1 杯状病毒概述16-17
• 1.2.2 杯状病毒受体17-19
• 1.3 病毒与宿主相互作用研究技术19-23
• 1.3.1 双杂交系统19-20
• 1.3.2 免疫共沉淀（Co-IP）20
• 1.3.3 串联亲和纯化技术20-21
• 1.3.4 GST-Pulldown技术21-22
• 1.3.5 双分子荧光互补技术（BiFC）22
• 1.3.6 其他蛋白质相互作用研究技术22-23
• 1.4 本研究的目的及意义23-24
• 第二章 稳定表达RHDV VPg蛋白RK-13细胞系的构建24-34
• 2.1 材料25-26
• 2.1.1 质粒、细胞系和菌种25
• 2.1.2 主要仪器设备25
• 2.1.3 主要试剂及抗体25
• 2.1.4 主要缓冲液及试剂的配制25-26
• 2.2 研究方法26-30
• 2.2.1 慢病毒包装质粒pLOV-3Flag-VPg的构建26-27
• 2.2.2 制备含VPg基因的重组慢病毒样颗粒27
• 2.2.3 表达VPg基因的RK-13细胞系的制备及阳性细胞株的筛选27-28
• 2.2.4 VPg基因组插入水平检测以及mRNA转录水平检测28-29
• 2.2.5 VPg蛋白表达水平Western blot检测以及间接免疫荧光（IFA）检测29-30
• 2.3 结果30-33
• 2.3.1 p LOV-3Flag-VPg重组质粒构建与鉴定30-31
• 2.3.2 稳定表达VPg的RK-13细胞筛选31
• 2.3.3 细胞基因组中外源基因以及其转录mRNA的检测31
• 2.3.4 Western blot检测和间接免疫荧光（IFA）分析外源基因蛋白表达31-33
• 2.4 讨论33-34
• 第三章 人工构建能在细胞中增殖的兔出血症病毒34-46
• 3.1 材料35-36
• 3.1.1 质粒和细胞系35
• 3.1.2 主要仪器设备、试剂及抗体35-36
• 3.1.3 主要缓冲液及试剂的配制36
• 3.2 方法36-38
• 3.2.1 构建含RHDVRGD突变株全基因的pRHDVRGD重组质粒36
• 3.2.2 RHDVRGD突变株的拯救36-37
• 3.2.3 RT-PCR鉴定RHDVRGD突变株37
• 3.2.4 间接免疫荧光IFA鉴定RHDVRGD突变株37
• 3.2.5 Western blot鉴定RHDVRGD突变株37
• 3.2.6 RHDVRGD突变株负染透射电镜观察37
• 3.2.7 RHDVRGD突变株动物回归实验37-38
• 3.2.8 RHDVRGD突变株免疫保护实验38
• 3.3 结果38-44
• 3.3.1 pRHDVRGD重组质粒构建与鉴定38-39
• 3.3.2 RHDVRGD病毒突变株拯救观察结果39-40
• 3.3.3 RHDVRGD病毒突变株RT-PCR鉴定40-41
• 3.3.4 RHDVRGD病毒突变株IFA鉴定41
• 3.3.5 RHDVRGD病毒突变株Western blot鉴定41-42
• 3.3.6 病毒突变株RHDVRGD透射电镜观察42
• 3.3.7 RHDVRGD突变株动物回归实验结果42-44
• 3.3.8 RHDVRGD突变株免疫保护实验结果44
• 3.4 讨论44-46
• 第四章 VPg在兔出血症病毒翻译起始阶段的功能研究46-65
• 4.1 材料和方法47-56
• 4.1.1 病毒cDNA与细胞系47
• 4.1.2 抗体与质粒47
• 4.1.3 主要试剂与仪器47
• 4.1.4 主要缓冲液及试剂的配制47
• 4.1.5 质粒构建47-48
• 4.1.6 质粒DNA转染方法48-49
• 4.1.7 荧光素酶活性检测49-50
• 4.1.8 qRT-PCR分析50-51
• 4.1.9 哺乳动物双杂交实验51
• 4.1.10 免疫共沉淀（Co-IP）实验51
• 4.1.11 双分子荧光互补（BiFC）实验51-52
• 4.1.12 siRNA干扰eIF4E功能实验52-53
• 4.1.13 4EBP1影响RHDV翻译实验53
• 4.1.14 RNA电泳迁移率变动分析(REMSA) 实验53-56
• 4.1.15 数据统计与分析56
• 4.2 结果56-64
• 4.2.1 VPg与RHDV基因组RNA 5′-末端序列相互作用56-57
• 4.2.2 VPg蛋白为RHDV的翻译所必需57-59
• 4.2.3 RHDV的VPg蛋白与翻译起始因子e IF4E相互作用59-62
• 4.2.4 VPg-eIF4E相互作用为RHDV翻译所必需62-63
• 4.2.5 干扰eIF4E基因对RHDV翻译的影响63-64
• 4.3 讨论64-65
• 第五章 全文结论65-66
• 参考文献66-76
• 致谢76-77
• 作者简历77

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 马吉飞,李佩国,史秋梅,董淑珍,高红珍;慢性兔出血症的研究[J];河北职业技术师范学院学报;2000年01期

2 付瑞,贺争鸣;兔出血症病毒分子生物学研究进展[J];实验动物科学与管理;2003年01期

3 李海,彭远义;兔出血症病毒的研究进展[J];贵州畜牧兽医;2004年02期

4 张玉颖;刘光清;吴润;;兔出血症病毒分子生物学研究进展[J];动物医学进展;2006年03期

5 倪征;魏威;刘光清;陈柳;余斌;云涛;华炯钢;李双茂;;兔出血症病毒在体外诱导细胞凋亡[J];病毒学报;2009年04期

6 杜念兴,徐为燕,刘胜江;一种新病毒——兔出血症病毒的鉴定初报[J];病毒学报;1986年02期

7 周q，

本文编号：1100166