茶树中CsECGT基因的克隆及其功能验证

发布时间：2017-11-05 08:25

  本文关键词：茶树中CsECGT基因的克隆及其功能验证

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【摘要】：酯型儿茶素是简单儿茶素c环3位羟基没食子酰基化的产物。已有资料表明：植物体内代谢物质的酰基化是在活性酰基供体的参与下完成的。目前在植物机体内发现有很多种活性酰基供体,能够催化物质的酰基化,如酰基硫酯化合物(CoA thioesters)、5-O咖啡酰奎尼酸(5-0- caffeoylquinate)、没食子酰基葡萄糖(1-O-galloyl-p-D-glucose)表儿茶素没食子酰基转移酶(epicatechin:1-O-galloyl-β-D-glucose-O-galloyltransferase ECGT)能够在植物体外催化简单儿茶素合成酯型儿茶素。但在茶树(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)中,证明该反应存在的证据还不清楚。茶树(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)中存在酯型儿茶素的水解酶。合成与水解反应的同时进行,很难判断ECGT就是茶树体内酯型儿茶素合成的关键酶。本研究通过CsECGT的原核表达、CsECGT序列分析、过表达载体的构建、ECGT的表达与提取、ECGT的功能验证等实验,获得了如下结果：1.成功构建了两个CsECGT原核表达系统：p ET28-ECGT/pET32-ECGT重组大肠杆菌。经过一系列的优化表达条件的探索,包括SDS-PAGE蛋白检测、酶纯化手段、生物转化、高效HPLC,都没有得到显著的实验结果。2.分析了CsECGT的基因序列：全长为1726 bp,其包含一个完整的编码区1443bp,5’非翻译区(UTR)72bp,3'非翻译区180 bp和polyA尾巴31 bp,编码区GC含量为51.83%，，编码480个氨基酸组成的蛋白(表儿茶素没食子酰基转移酶)。通过blast软件在线比较分析,发现CsECGT编码的氨基酸序列与其它物种的丝氨酸酰基转移酶(Serine acyltransferase)具有较高的一致性,尤其与来玉米(Zea mays)、潘那利番茄(Solanum pennellii)、蝶豆(Clitoria ternatea)的丝氨酸酰基转移酶的相似性达40%以上。3.成功构建了ECGT过表达载体pCXSN-ECGT、对照空载体pCDG-CCDB,并将其转入到农杆菌GV3101中。4.通过农杆菌GV3101介导,成功将过表达载体pCXSN-ECGT、空载体pCDG-CCDB导入到烟草(Nicotiana tabacum L.)鲜叶中。经过诱导分化、生根,最终获得了阳性植株。5.根据过表达载体自身序列的特征设计了引物HybF(5'-TGTCCTGCGGGTAAATAGC-3')HybR(5'-GTCCATCACAGTTTGCCAGT-3'),成功鉴别了诱导体系的可行性(抗性筛选)；结合载体表达的选择方向性与CsECGT基因的序列特点,设计引物CXSN-SeqF(5'-CATGCTTAACGTAATTCAACAG-3'). CXSN-SeqR(5'-AATCAAGCATTCTACTTCTATT-3'),验证了阳性结果。6.提取了阳性烟草(Nicotiana tabacum L.)叶片中的粗酶,进行了SDS-PAGE电泳。结果表明：CsECGT基因在烟草中大量表达,且其片段大小为55 KD。7.用甲醇+甲酸直接提取烟草(Nicotiana tabacum L.)鲜叶物质,液相检测结果表明：一定鲜叶量下的该提取物,没有观察到其它儿茶素。用50 mM磷酸缓冲液提取烟草鲜叶里的酶,建立了ECTG酶体外反应体系。初步得到了CsECGT基因编码的酶,对作用底物EC/EGC具有差异性。
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S571.1

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1 吴敦超;茶树中CsECGT基因的克隆及其功能验证[D];湖南农业大学;2015年

本文编号：1143411