利用Split-Intein内含肽介导蛋白功能恢复创建双组分雄性不育系的研究

发布时间：2017-11-16 21:13

  本文关键词：利用Split-Intein内含肽介导蛋白功能恢复创建双组分雄性不育系的研究

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【摘要】：目前,尽管通过基因工程手段已经实现了植物细胞核不育,但得到的不育系与相应保持系杂交后仅能得到50%的不育株,其余50%的可育株需要去除。如何获得不育率为100%的核不育系是目前雄性不育研究的重点。为实现上述目的,本研究将毒蛋白基因Barnase和草甘膦抗性基因G2-EPSPS分拆为无活性的N端和C端两个片段并分别与Ssp DnaE内含肽和Npu DnaE内含肽的N端和C端融合,分别构建pCABarESN、pCABarESC、pCABarSNZESN、pCABarSCZESC植物表达载体以及pCABarESP、pCABarABn两个对照载体。分别将其导入芥菜和甘蓝植株,研究利用Split-Intein内含肽介导分拆蛋白结构和功能重建实现100%雄性不育的可行性。获得的主要研究结果如下：1、芥菜中实现了Npu DnaE内含肽介导split-EPSPS基因功能重建利用农杆菌介导法,将pCABarESN、pCABarESC载体以及对照载体pCABarESP分别转化芥菜,获得相应的转基因芥菜植株。经PCR, RT-PCR分析结果显示ESN, ESC, G2-EPSPS基因已转入芥菜植株并表达。PPT抗性筛选结果显示,部分pCABarESN、pCABarESC转基因植株中的ESN, ESC基因为多个位点插入芥菜基因组。草甘膦抗性筛选结果表明,仅表达G2-EPSPS基因N端和C端片段的pCABarESN、pCABarESC转基因芥菜植株不具有草甘膦抗性,表达G2-EPSPS基因完整序列的pCABarESP转基因芥菜植株具有草甘膦抗性。而pCABarESN、pCABarESC转基因芥菜植株杂交后代因Npu DnaE内含肽的介导的G2-EPSPS蛋白结构和功能重建,植物具有草甘膦抗性。2、获得了芥菜双组分雄性不育亲本植株将pCABarSNZESN、pCABarSCZESC植物表达载体转入芥菜植株,获得具有PPT抗性的芥菜植株双组分雄性不育亲本植株,经PCR检测目的基因已整合到芥菜基因组中。3、获得了转基因雄性不育甘蓝植株BcA9驱动下的核糖核酸酶Barnase基因植物表达载体pCABarABn,通过农杆菌介导的下胚轴转化导入甘蓝材料‘TF’,获得具有除草剂Basta抗性的甘蓝转基因植株。细胞学观察显示,转基因甘蓝植株的花药因绒毡层细胞提前降解,花粉母细胞退化,成熟花药中无正常花粉粒产生。相对非转基因对照,转基因甘蓝植株花器官变小,花瓣褶皱多,柱头弯曲,雄蕊瘦小等现象。另外,转基因植株在温度低于22℃时出现明显的死蕾现象,当温度高于25℃时,死蕾现象得到缓解。田间结实情况调查显示,转基因甘蓝植株自交不能结实,与野生型杂交可结实但种荚变短。4、获得了甘蓝双组分雄性不育亲本植株将pCABarSNZESN、pCABarSCZESC植物表达载体转入甘蓝植株,获得具有PPT抗性的甘蓝双组分雄性不育亲本植株,经PCR检测目的基因已整合到甘蓝基因组中,RT-PCR分析结果显示,ESN、ESC基因在pCABarSNZESN、 pCABarSCZESC转基因甘蓝叶片中正常表达；SN, SC基因在pCABarSNZESN、 pCABarSCZESC转基因甘蓝花蕾中正常表达。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2;S63

【参考文献】

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本文编号：1193698