基于丹参KSL基因“产地趋向变异”规律初步解析丹参道地性遗传特征

发布时间：2017-12-07 01:26

  本文关键词：基于丹参KSL基因“产地趋向变异”规律初步解析丹参道地性遗传特征

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【摘要】：丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)是中医临床常用的中药材,其质量问题一直是近些年来的研究热点。因此阐明丹参的道地性是质量问题研究的核心内容。而要解决道地性问题,解析丹参道地性遗传机制则是关键。丹参酮类成分是丹参的重要活性成分,它产生的机制具有很重要的研究意义。作为丹参酮类成分合成途径下游的关键酶-丹参类贝壳杉烯合酶(SmKSL)将对丹参药材有效成分的含量产生直接的影响。研究发现丹参类贝壳杉烯合酶(SmKSL)基因具有明显的"产地趋向变异"(GVT)特征,并以此关键基因作为模板,克隆了不同产地丹参的SmKSL基因,测序,分析基因序列及其编码的蛋白的序列的变异位点,并构建了原核表达载体,进行体外诱导蛋白的表达,进而进行体外的酶促反应,酶促反应的产物运用GC-MS技术进行分析检测。通过产物峰强度比较酶的催化效能,从而解析丹参功能基因的GVT规律对关键酶生物合成功能的影响,从而探究丹参道地性的遗传特征。具体研究成果如下:1、成功克隆SmKSL基因全长,并发现其具有"产地趋向变异"规律克隆得到的SmKSL基因全长为1788bp,理论上表达蛋白的分子量是68千道尔顿,该SmKSL蛋白具有一定的亲水性,且结构较稳定。我们通过序列的比对发现,丹参贝壳杉烯合酶具有7个可供分析的产地趋向变异位点,分别位于 246bp,669bp,709bp,1047bp,1048bp,1356bp,1491bp 处,其中有非同义突变2处,同义突变有4处。河北、内蒙、山东、四川、山西居群存在产地特化变异类型。并且不同产地丹参居群"产地趋向变异"的突变位点出现了较多的"非同义突变"。其中山西居群、湖北居群的SmKSL基因在349bp处的产地趋向变异位点导致异亮氨酸"I"突变为缬氨酸"V",河南居群255bp处产地趋向变异位点导致精氨酸"R"变半胱氨酸"C"。2、构建pET-SmKSL原核表达载体本课题成功的构建了 SmKSL原核表达载体,诱导表达的最佳温度为20℃,诱导时间是12小时,IPTG浓度为1.0 mM,A600为1.0,经不同浓度咪唑洗脱后,确定最佳洗脱浓度为30mM咪唑,经PCR扩增及测序验证,证明原核表达体系成功建立。3、SmCPS蛋白的表达根据首都医科大学高伟教授提供的SmCPS菌株,并按照参考文献进行诱导表达,诱导温度为20℃,诱导时间为10小时,IPTG浓度为0.4mM,OD600为0.8,SmCPS具有较大的表达量。4、成功验证了 SmKSL基因的功能及不同产地基因型对催化效率的影响对SmKSL进行功能验证的催化反应是通过以GGPP作为反应底物,经SmCPS酶催化所产生的产物-CPP来作为下一步催化反应的底物,然后加入SmKSL酶进行催化。结果证明SmKSL具有催化柯巴基焦磷酸(CPP)得到二萜烯类产物次丹参酮二烯的功能。山西产丹参的催化效能是最高的,催化效能由高至低依次为HUB、SD、SC、HN、NM、HB。综上所述,本研究发现SmKSL具有产地趋向变异现象,它的催化效能结果间接显示了各个产地催化效能的高低,从一定程度上印证了丹参的道地性。因此,本课题可以为丹参的道地性提供一种合理的解释,并阐明其遗传机制。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S567.53

【参考文献】

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本文编号：1260698